Resumen

La productividad bovina está basada en su eficiencia reproductiva por lo que existen un gran número de protocolos hormonales de sincronización de la ovulación, sin embargo, existe una tendencia a nivel mundial de reducir el uso de hormonas en los sistemas de producción y actualmente no existen protocolos de sincronización que no se basen en hormonas. El objetivo de este estudio fue implementar un protocolo alternativo no hormonal de sincronización de estros evaluado por biología molecular. La investigación se realizó en una unidad de producción pecuaria ubicada en la zona norte de Veracruz. Se utilizaron 12 novillonas mestizas (Bos indicus x Bos taurus) de 24.0±3.0 meses de edad y un peso de 324.0±15.0 kg. Las novillonas fueron sincronizadas utilizando el protocolo ovsynch. Doce días después del estro se conformaron aleatoriamente tres grupos: 1) Control (n=4), no se manipularon reproductivamente, 2) Control (n=4) con diagnóstico (ultrasonografía) de cuerpo lúteo (CL) y 3) Diagnóstico con ultrasonografía de CL y tratamiento de masaje uterino por dos minutos (n=4). Se tomaron muestras de sangre antes y después del procedimiento para la extracción de material genético (DNA RNAm) y determinar por PCR la expresión de genes de PGF2α y oxitocina. La detección de celos se realizó AM y PM durante 5 días. El 50% (2/4) de las novillonas que recibieron masaje uterino mostraron estro, del grupo 2, el 25% presentó celo y del grupo 1 (control) ninguna novillona presentó celo. El diagnóstico molecular indicó que el masaje uterino por dos minutos provocó la expresión de los genes de prostaglandina F2α y de oxitocina. En conclusión, el masaje uterino por dos minutos estimuló la actividad de genes para producir prostaglandina-F2α y oxitocina y se plantea como protocolo alternativo no hormonal de sincronización de estros. No obstante, es necesario realizar más estudios para determinar el número, ocurrencia, periodicidad y temporalidad de manipulación uterina para mejorar la manifestación de celos. 

Palabras clave: PGF2α, Oxitocina, masaje uterino, expresión genética, cuerpo lúteo.

Introducción
 

Un fenómeno que ha tomado fuerza en los últimos años es el incremento en la demanda de productos de origen orgánico y/o sustentable, lo cual ha impactado favorablemente en un crecimiento en el número de hatos lecheros orgánicos certificados (Sorge et al., 2016). Para obtener la certificación de productos orgánicos deben cumplirse algunas normas como: 1) Los animales mayores de seis meses de edad necesitan consumir por lo menos el 30% de materia seca del potrero y pastorear un mínimo de 120 días del año, 2) Está prohibido el uso de antibióticos y de todas las hormonas excepto oxitocina que permite su uso en vacas con patologías posparto (Sorge et al., 2016). Esta última norma genera un serio problema para el manejo reproductivo de estos hatos, ya que no pueden utilizar protocolos de sincronización de la ovulación y el manejo reproductivo se tiene que basar en detección de celos que desafortunadamente tienen bajos porcentajes; una alternativa es mantener monta continua todo el año. La falta de protocolos hormonales en estos hatos orgánicos dificulta obtener buenos parámetros reproductivos. Por tal motivo, el objetivo del presente estudio fue implementar un protocolo alternativo no hormonal de sincronización de estros para ganaderías bovinas orgánicas y/o sustentables evaluado por biología molecular

Material y Metódos
 

El estudio se realizó en una unidad de producción pecuaria ubicada en el municipio de Cazones, Veracruz. Durante el año la temperatura oscila de 18 a 32 °C, y una precipitación anual entre 1400 y 1600 mm. 

Para el estudio se utilizaron 12 novillonas (Bos taurus x Bos indicus) manejadas en un sistema de rotación intensiva de pastos tropicales: brizanta (Brachiaria brizantha) y estrella de África (Cynodon plectostachyus). Además, se le proporcionaron sales minerales y agua fresca a libre acceso. Las novillonas seleccionadas para el estudio fueron diagnosticadas con un cuerpo lúteo (mediante ultrasonografía) garantizando que habían alcanzado la pubertad, tenían una edad de 24.0±2.0 meses, un peso de 323.9±19.0 Kg y una condición corporal de 3.83±0.17 (escala de 1 – 5, de acuerdo a Ferguson et al., 1994). 

Inicialmente las novillonas recibieron un protocolo de inducción de la ovulación a tiempo fijo (Purslaey et al., 1995) y en el día 12 del ciclo estral las novillonas fueron asignadas aleatoriamente a uno de los siguientes tratamientos: 1) Grupo control sin diagnóstico de cuerpo lúteo (CL, n = 4): a estas novillonas no se les realizó ultrasonografía para determinar la presencia de CL para no inducir liberación de hormonas por manipulación, 2) Grupo con diagnóstico de cuerpo lúteo (N = 4): a estas novillonas se les realizó ultrasonografía para determinar la presencia de CL y 3) Grupo tratado (n = 4): en el cuál se realizó primeramente ultrasonografía para determinar la presencia de CL seguido de un masaje uterino por dos minutos.

Se colectaron muestras de sangre periférica directamente del plexo sanguíneo de la base de la cola en tubos vacutainer de todas las novillonas para determinar la activación de genes de prostaglandina F2α y oxitocina. Las muestras se tomaron de la siguiente manera: la primera muestra de sangre se tomó cuando los animales entraron a la manga de trabajo y antes de realizar cualquier diagnóstico reproductivo o masaje uterino. Las siguientes muestras de sangre fueron tomadas cada 30 minutos hasta completar 240 minutos después de iniciado el muestreo. 

Para obtener las expresiones hormonales se realizó la extracción de ARN mediante el protocolo de extracción con una mezcla de tiocianato de guanidina y fenol monofásico (Mirando-Ortiz et al., 2021) a partir de muestras de sangre total. Se logró identificar la calidad del material genético mediante la amplificación de un segmento parcial de ≈620 de la citocromo oxidasa subunidad 1 (COI), lo que indicó la suficiente carga de material genético para procesar PGF2α y oxitocina.

No se utilizó un método tradicional midiendo las concentraciones en sangre del metabolito de la PGF2α (13,14-dihidro-15-ceto-prostaglandina F2α; PGFM) si no que se utilizó otro método para identificar la expresión genética codificada para la hormona PGF2α y oxitocina, es decir se determinó la activación de los genes de estas dos hormonas. Para ello en este estudio se implementó el uso de biología molecular mediante la extracción de ARN posteriormente convertido a ADNc para observar la actividad genética de la codificación de el gen codificador de PGF2α. Se trabajó con primer ptge2s y ptge3s para observar la expresión genética.

Después del procedimiento se pintó con crayón para ganado la región sacro-coccígea como auxiliar en la detección de celos que se realizó AM y PM por periodos de 30 minutos durante cinco días. 

Resultados

El masaje uterino tuvo un efecto en la activación del gen codificador de PGF2α. Se observó un incremento en la actividad a los 60 minutos después del estímulo uterino y se mantuvo la actividad de la expresión genética hasta el minuto 180 (2 horas), posteriormente, en el minuto 240 disminuyó esta expresión del gen (Imagen 1), sin embargo, en los grupos control con y sin diagnóstico de cuerpo lúteo se alcanzó a apreciar una baja activación del gen en el minuto 120. Es importante resaltar que el masaje uterino por dos minutos fue capaz de estimular la activación del gen codificador para la liberación de la prostaglandina F2α (Imagen 1).

Se inició un incremento en la actividad del gen codificador de oxitocina 60 minutos después de iniciado el masaje uterino, pero del minuto 120 hasta 240 la actividad se mantuvo muy pronunciada (tres horas; Imagen 2). Sin embargo, en los grupos control con y sin diagnóstico de cuerpo lúteo se manifestó poca actividad del gen codificador de oxitocina desde los 150 a los 240 minutos (Imagen 2).
 

Se diagnosticaron en estro dos de las cuatro (50%) novillonas del grupo de masaje uterino, una de las cuatro (25%) del grupo control con diagnóstico de cuerpo lúteo mediante ultrasonografía y ninguna (0%) del grupo control sin diagnóstico de cuerpo lúteo. Estadísticamente no hubo diferencias (P  0.05) pero esto pudo ser por la n del estudio. 
 

Discusión

El masaje uterino por dos minutos fue suficiente tiempo para estimular la activación del gen codificador de PGF2α. Las novillonas que recibieron el masaje uterino tuvieron un incremento en la actividad del gen codificador de PGF2α por dos horas aproximadamente. Otros estudios (Velez et al., 1990; Tolleson y Randel, 1987) demostraron que el masaje uterino fue capaz de aumentar las concentraciones de PGF2α que fue medida por medio del metabolito de está que es el 13,14-dihidro-15-ceto-prostaglandina F2α (PGFM) debido a que este metabolito es más estable que la hormona y se puede obtener de sangre periférica. 
 

En relación al gen codificador de oxitocina también se activó por el masaje uterino, solo que este gen tuvo una activación por un tiempo más prolongado, de casi tres horas. No existen estudios similares para poder realizar una comparación entre resultados; sin embargo, se puede mencionar que en el proceso de regresión del cuerpo lúteo existe un mecanismo de retroalimentación entre las hormonas PGF2α y oxitocina, este modelo fue demostrado por McCracken et al., en 1991.
 

Entonces es posible que el masaje uterino activará las células del endometrio para secretar PGF2α y está al actuar en su tejido blanco que es el cuerpo lúteo (células luteales grandes) activará el gen codificador de oxitocina como parte del proceso natural de retroalimentación durante la luteólisis. Es importante mencionar que durante el proceso de regresión del cuerpo lúteo este mecanismo de retroalimentación se da de manera pulsátil y requieren de varios pulsos para que su regresión sea exitosa (McCkraken et al., 1991). 
 

La inducción de celos por masaje uterino solo tuvo el 50% de éxito a pesar de que se activaron los genes codificadores de PGF2α y oxitocina, en el grupo control con diagnóstico de cuerpo lúteo por ultrasonografía se presentó el 25% de celos y en el grupo control sin diagnóstico no se presentaron animales en estro. La explicación de que solo el 50% de los animales hayan manifestado celo puede decirse que tal vez se necesita uno o dos masajes uterinos más para incrementar el número de pulsos liberadores de oxitocina y PGF2α y que la regresión del cuerpo lúteo sea exitosa sin la utilización de hormonas. En este momento se desconoce el número, ocurrencia, periodicidad y temporalidad de masajes uterinos para mejorar la manifestación sincronizada de celos con esta herramienta. 
 

Es difícil comparar con otros estudios debido a que la mayoría de los estudios realizados sobre este tema se enfocaron en los beneficios del masaje uterino en mejorar la fertilidad días o semanas después de estímulo y no en estudiar la posibilidad de una inducción de regresión del cuerpo lúteo y un estro sincronizado.
 

Adicionalmente, el intervalo entre pulsos de PGF2α está determinado por la pérdida de la sensibilidad del endometrio a la oxitocina y por el tiempo que tarda en recuperarla y por ello el ciclo se interrumpe. El periodo de tiempo para que el endometrio recupere la sensibilidad a la oxitocina es de aproximadamente 6 horas; por este motivo, los pulsos de PGF2α se presentan con un intervalo de 6 a 8 horas. La secreción pulsátil de PGF2α continúa hasta que se completa la regresión del cuerpo lúteo y se necesitan de 5 a 6 pulsos para que sea exitosa la regresión del cuerpo lúteo.
 

Conclusión

Estos resultados son muy alentadores debido a que el masaje uterino se podría utilizar como protocolo alternativo sin el uso de hormonas en la sincronización de estros en las ganaderías orgánicas y/o sustentables. Sin embargo, es necesario realizar más estudios para determinar el número, ocurrencia, periodicidad y temporalidad de masajes uterinos para mejorar la manifestación de celos. 
 

Este estudio se puede considerar muy innovador por dos razones: 1) Es el primer reporte que implementa el masaje uterino como herramienta reproductiva simple, económica y amigable con el ecosistema y los animales, utilizada hace más de 20 años ahora con un enfoque novedoso al proponerse como un protocolo alternativo en la sincronización de estros en ganaderías amigables al ecosistema y 2) el desarrollo e implementación de la biología molecular a nivel sanguíneo como alternativa cualitativa ante la serología convencional para cuantificar los niveles hormonales en un protocolo reproductivo alternativo.
 

Bibliografía

Ferguson, J.D., Galligan, D.T. y Thomsen, N.  1994. Principal descriptors of body condition score in Holstein cows. J. Dairy Sci. 77:2695–2703. 

McCracken, J.A., Schramm, W. y Okulicz, W.C. 1984.  Hormone receptor control of pulsatile secretion of PGF-2Alfa from the ovine uterus during luteolysis and its abrogation in early pregnancy. Anim. Reprod. Sci. 7:31-55.

Miranda-Ortiz, H., Fernández-Figueroa, E. A., Ruíz-García, E. B., Muñoz-Rivas, A., Méndez-Pérez, A., Méndez-Galván, J., Astudillo-de la Vega, H., Gabiño-López, B., Nava-Monroy, R., López-Flores A la Torre, A., López-Vergara Anaya, T., Vilar-Compte, D., Coquis-Navarrete, U., Valdés-Reyes, M., Sánchez-Montes, S., & Becker, I. (2021). Development of an alternative saliva test for diagnosis of SARS-CoV-2 using TRIzol: Adapting to countries with lower incomes looking for a large-scale detection program. PloS one, 16(8), e0255807. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0255807

Sorge, U.S., Moon, R., Wolff, L.J., Michels, L., Schroth, S., Kelton, D.F. y Heins, B. 2016. Management practices on organic and conventional dairy herds in Minnesota. J. Dairy Sci. 99:3183–3192.

Tolleson D, R. y Randel, R.D. 1988. Effects of alfaprostol and uterine manipulation on postpartum interval and pregnancy rate to embryo transfer in Brahman influenced beef cows. Theriogenology 29:555-560. 

Velez, J.S., Randel, R.D. y Neuendorff, D.A. 1991. Effect of uterine manipulation on postpartum fertility and plasma 13, 14 – dihydro – 15 keto – prostaglandin F2 in Brahman cows and first-calf heifers.  Theriogenology 36 (6):987-998.