Por parte de la Universidad de Arkansas, quiero reconocer a los Dres. Billy M. Hargis, Guillermo Téllez Isaias, Raúl Macon, Juan D. Latorre, Makenly Coles, Latasha Gray, Lauren Laverty, Kristen Martin, Fernanda Bravo e Ileana Bravo. Y por parte de la Universidad Nacional Autónoma de México, al Dr. Rubén Merino.

INTRODUCCIÓN 

Los antibióticos se han utilizado ampliamente en la producción animal, tanto con fines terapéuticos como en forma de antibióticos promotores de crecimiento (APC). Aunque existe una creciente preocupación por la aparición de resistencia a los antimicrobianos (AMR) en las poblaciones bacterianas. La producción de pollos suele ser difícil con la prohibición o las restricciones de los APC, ya que tiene cada vez más dificultades para hacer frente a patógenos entéricos como Salmonella. El uso de aditivos como las enzimas ha atraído recientemente la atención en el sector avícola, como es el caso de la glucosa oxidasa. 

La glucosa oxidasa (GOx) es una enzima que cataliza la oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico y peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Este proceso se lleva a cabo en dos pasos: 

• Oxidación de la glucosa: La GOx se une a la D-glucosa y la oxida utilizando oxígeno molecular (O²) como cofactor. El oxígeno molecular se reduce a peróxido de hidrógeno (H₂O₂), el cual es un oxidante fuerte que puede matar a las bacterias al dañar su membrana celular y por su capacidad para oxidar componentes esenciales de las bacterias, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.
   
• Hidrólisis de la gluconolactona: La gluconolactona se hidroliza espontáneamente a ácido glucónico, el cual reduce el pH del entorno, lo que también puede ser perjudicial para las bacterias. 

Esta enzima procede naturalmente de ciertas cepas de hongos de Aspergillus y Penicillium, especialmente A. niger y P. amagasakiense. En la producción avícola, la GOx ha mostrado beneficios como la inhibición del crecimiento de bacterias nocivas como Clostridium perfringens, Salmonella y Escherichia coli, debido al peróxido de hidrógeno, el cual actúa como un potente agente antimicrobiano y antioxidante que ayuda a reducir la carga de estrés oxidativo dentro del cuerpo del pollo mediante la neutralización de los radicales libres dañinos y, a su vez, contribuye a una mejor función inmune, resistencia a las enfermedades y un mejor rendimiento general.

Por otro lado, uno de los probióticos de mayor interés en la industria avícola es el Bacillus, el cual ha demostrado ser eficaz en la promoción del equilibrio microbiano intestinal y en la mejora del rendimiento productivo de las aves. Un producto comercial que contiene tres especies de Bacillus: subtilis, amyloliquefaciens y licheniformis, los cuales se han seleccionado por sus propiedades probióticas y su capacidad para beneficiar la salud intestinal, fortalecer el sistema inmunitario y promover el rendimiento de las aves, se ha utilizado como una alternativa a los antibióticos tradicionales, especialmente en la mitigación de Salmonella Enteritidis. Los Bacillus, como bacterias probióticas, pueden competir con las bacterias patógenas como Salmonella por recursos y espacio en el intestino, reduciendo así su capacidad para colonizar y causar infecciones. Además, algunos Bacillus tienen la capacidad de producir compuestos antimicrobianos y modular la respuesta inmune para inhibir el crecimiento de Salmonella y otras bacterias patógenas. Estudios in vitro e in vivo han demostrado el potencial de Bacillus como probiótico.
 

MATERIAL Y MÉTODOS 

El estudio se dividió en dos experimentos independientes: 
 

• Experimento 1. Efecto de la glucosa oxidasa y Bacillus sobre la infección con S. Enteritidis.
   
• Experimento 2. Efecto de la glucosa oxidasa y Bacillus sobre parámetros productivos de los pollos de engorda.  
   

Se utilizaron pollitos de engorda machos Cobb 500 (n= 620) de un día de edad procedentes de una incubadora comercial. A diez pollitos se les aplicó eutanasia mediante CO² para descartar la presencia de Salmonella a su llegada, a fin de llevar a cabo el proceso de manera que no interfiriera con evaluaciones posteriores. Se recolectaron muestras de tonsilas cecales, hígado y bazo para la recuperación de Salmonella como se describe a continuación: los órganos se cultivaron asépticamente en caldo de enriquecimiento con tetrationato. Posteriormente las muestras enriquecidas se confirmaron negativas para Salmonella mediante la siembra de las muestras en placas de medio selectivo Xilosa Lisina Tergitol-4.

La enzima utilizada en el estudio fue glucosa oxidasa de Aspergillus niger, grado alimentario, con una actividad de 10,320 unidades por gramo sólido. La enzima se añadió al alimento para crear la dieta experimental con una concentración final de 100 U/Kg de alimento.

El producto comercial utilizado de Bacillus es un cultivo DFM (Direct Feed Microbial, microbios directo en el alimento), compuesto por esporas de tres especies: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis. El producto contiene una concentración de 10¹¹ esporas estables /g sólido. Se añadió DFM al alimento para obtener la dieta experimental con Bacillus con una concentración final de 10⁶ esporas/g de alimento.

 
1. Experimento 1. Efecto de la glucosa oxidasa y Bacillus sobre la infección con S. Enteritidis. 
El objetivo principal de este experimento fue determinar el efecto de la suplementación de glucosa oxidasa y Bacillus en el alimento sobre la infección por S. Enteritidis, evaluando la invasión bacteriana en órganos mediante la recuperación y conteo de S. Enteritidis y el desarrollo de la inmunidad local con la medición de la concentración de anticuerpos (IgY) en el suero de aves en respuesta a la infección. 

 
1.1 Diseño experimental 
Los pollitos se pesaron individualmente y se asignaron aleatoriamente a uno de los cinco grupos, tres réplicas por grupo (n = 14 pollitos/grupo) como se muestra en el cuadro 1:  
 

A los pollos que recibieron desafío se les administró 10⁸ UFC de S. Enteritidis por vía oral a los 7 días de edad. Posteriormente, a los 7 y 14 días después de la inoculación (14 y 21 días de edad), a 12 pollos por grupo (4 pollos por réplica), se les aplicó eutanasia por inhalación de CO² y fueron sangrados por vena femoral para obtener suero para la determinación de IgY específica para Salmonella Enteritidis. A su vez, se recolectaron las tonsilas cecales, hígado y bazo, para la recuperación de Salmonella.
 

2. Experimento 2. Efecto de la glucosa oxidasa y Bacillus sobre parámetros productivos de los pollos de engorda. 
El objetivo del segundo experimento fue determinar el efecto de la suplementación de glucosa oxidasa y Bacillus en los parámetros productivos y la integridad intestinal de los pollos de engorda. Para evaluar los parámetros productivos, se analizó el rendimiento, mientras que, para evaluar la integridad intestinal, se realizaron mediciones de inmunidad local mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para determinar los niveles de IgA total en lavados intestinales. Además, se llevó a cabo la determinación sérica de dextrano-isotiocianato de fluoresceína-dextrano (FITC-d) como indicador del transporte paracelular y la disfunción de la barrera mucosa.
 

Los pollitos se pesaron individualmente y se asignaron aleatoriamente a uno de cuatro grupos, diez réplicas por grupo (n = 10 pollitos/grupo) como se muestra en el cuadro 2:  

En este caso, se evaluaron los parámetros de rendimiento, peso corporal (PC), ganancia de peso corporal (GPC), consumo de alimento (CA) e índice de conversión (IC) los días 1, 7, 14 y 21.

Al concluir el período experimental (21 días), se llevó a cabo la eutanasia de los pollos por inhalación de CO², fueron sangrados 20 pollos (2 por réplica) por la vena femoral para obtener suero para la determinación de dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-d), la dosis de FITC-d se calculó en función del peso corporal del grupo al día 21. Además, se recolectaron órganos para el análisis de varios indicadores de la integridad intestinal: muestras intestinales, para realizar lavados y cuantificar la inmunoglobulina A (IgA) total presente en la mucosa intestinal. 
 

RESULTADOS

1. Experimento 1. Efecto de glucosa oxidasa y Bacillus sobre la infección con S. Enteritidis. 
1.1    Recuperación y conteo de Salmonella Enteritidis  
Aunque no hubo diferencias estadísticas significativas, se observaron tendencias a la reducción del recuento de SE y su incidencia en ambos días y tejidos de los pollos con suplementación en el alimento en comparación con el grupo control positivo. En el día 14, en el recuento de SE en tonsilas cecales (TCC) el grupo tratado con Bacillus tuvo una reducción de la colonización del 17%, mientras que la suplementación con glucosa oxidasa resultó en la reducción de la colonización del 25%. Sin embargo, la combinación de Bacillus y glucosa oxidasa mostró una mayor reducción, alcanzando una reducción del 50%. En cuanto al hígado/bazo (H/B) se observaron resultados similares.  

En el día 21, se mantuvieron las diferencias observadas en el recuento de SE en tonsilas cecales (TCC). El grupo control negativo mostró una colonización del 0%, mientras que el grupo control positivo presentó una colonización del 92%. Tanto el grupo tratado con Bacillus como el grupo tratado con glucosa oxidasa, así como la combinación de ambos, mostraron una reducción similar en la colonización de 8% y 25% respectivamente. En el hígado/bazo (H/B) los resultados también reflejaron reducciones en la colonización de los grupos tratados. 
 

1.2 Niveles de IgY en suero específica de Salmonella Enteritidis 
No se encontraron diferencias estadísticas significativas en los niveles de IgY entre los grupos en ambos días de muestreo. Sin embargo, el grupo tratado con Bacillus mostró los niveles más bajos de IgY, mientras que el grupo tratado con Bacillus y glucosa oxidasa en el día 14 presentó los niveles más altos. Y en el día 21 los niveles más altos se presentan en el grupo tratado con glucosa oxidasa. 
 

2. Experimento 2. Efecto de glucosa oxidasa y Bacillus sobre parámetros productivos de los pollos de engorda. 
2.1 Parámetros de rendimiento 
Con respecto a los parámetros de rendimiento, el uso de Bacillus demostró mejoras significativas en varios parámetros de rendimiento en pollos de engorda en comparación con otros grupos de tratamiento durante el período experimental: el grupo tratado con Bacillus exhibió un peso corporal significativamente mayor en comparación con el grupo control y otros grupos tratados en diferentes etapas del ciclo de producción. La ganancia de peso diaria en los pollos de engorda del grupo tratado con Bacillus fue superior en comparación con los otros grupos. A pesar del incremento en el peso corporal y la ganancia de peso, el grupo tratado con Bacillus mantuvo un consumo de alimento similar en comparación con otros grupos. Esto sugiere una eficiencia en la utilización de nutrientes, ya que se observó un incremento sustancial en la ganancia de peso sin un aumento proporcional significativo en el consumo de alimento. Finalmente, también se muestra un índice de conversión significativamente mejorado en relación con los otros grupos en 1 a 14 días de edad. 
 

2.2 Niveles totales de IgA intestinal y concentración sérica de FITC-d  
En el caso de los niveles totales de IgA intestinal, se produjo una reducción en la concentración promedio de IgA de los grupos tratados en comparación con el grupo control. La suplementación con Bacillus o GOx en la dieta de los pollos redujo la concentración de IgA intestinal total a los 21 días de edad, aunque la combinación de estos incrementó los niveles.  

Con respecto a la concentración sérica de FITC-d, no hay diferencia significativa del grupo control con respecto al grupo tratado con GOx. Sin embargo, se encontraron diferencias estadísticas significativas entre el grupo control con el grupo tratado con Bacillus y el grupo con Bacillus + GOx. 
 

DISCUSIÓN 

Experimento 1. Efecto de glucosa oxidasa y Bacillus sobre la infección con S. Enteritidis. 
Recuperación y conteo de Salmonella Enteritidis  
Aunque no se encontraron diferencias estadísticas significativas, se observaron tendencias a la reducción del recuento de SE y su incidencia en ambos días (14 y 21) y tejidos (tonsilas cecales y hígado/bazo) en los pollos suplementados en comparación con el grupo control positivo. Estas tendencias hacia la reducción son consistentes con varios estudios publicados en los últimos años que han investigado el uso de probióticos y enzimas como estrategias para controlar la colonización de Salmonella en aves. 
 

Niveles de IgY en suero específica de Salmonella Enteritidis 
La respuesta inmunológica de las aves a la exposición a Salmonella se evalúa midiendo los niveles de IgY específica en el suero. 

Los resultados de nuestro experimento son similares a otras investigaciones, en las cuales no encontraron diferencias estadísticas significativas pero sí describieron un aumento de la IgY sérica en aves que recibieron alimentos suplementados con diferentes muestras de Lactobacillus con respecto al grupo control negativo, como fue en nuestro caso. Puede haber varias razones por las que Salmonella no montó una producción de anticuerpos después del desafío con la bacteria en pollos, una de estas razones puede ser que Salmonella infectó a los pollos, pero no logró colonizar el tracto gastrointestinal entre el desafío y el muestreo (según nuestros resultados de TCC e H/B). 
 

Experimento 2. Efecto de glucosa oxidasa y Bacillus sobre parámetros productivos de los pollos de engorda. 
Parámetros de rendimiento 
En este estudio, investigamos el efecto de un producto comercial a base de tres Bacillus: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis, los cuales han reportado un efecto sinérgico. En estudios anteriores se informó la capacidad de las esporas de Bacillus para germinar y enumerarse en el tracto gastrointestinal de las aves, mejorando el aumento de la digestibilidad de los nutrientes, la mejora de la morfología intestinal, el equilibrio de la microbiota intestinal, la modulación de la inmunidad y los parámetros de rendimiento. Nuestros resultados mostraron que la administración de Bacillus en pollos de engorda resultó con mejora en el peso corporal, ganancia de peso, eficiencia en la conversión alimenticia y mantuvo un consumo de alimento adecuado. 
 

Niveles totales de IgA intestinal y concentración sérica de FITC-d  
Comenzando con los niveles totales de IgA intestinal, los resultados muestran una diferencia estadística significativa en los grupos tratados en comparación con el grupo control. Los niveles más altos de la concentración de IgA se presentó en el grupo control y puede deberse a que la producción de IgA secretora sirve como primera línea de defensa para proteger el epitelio intestinal de toxinas entéricas e inhibir la adhesión e invasión de microorganismos patógenos, así como para proteger el intestino de los alimentos, antagonizar los procesos inflamatorios y mejorar los mecanismos de defensa no específicos, por lo cual, al no haber algún aditivo como lo es el Bacillus o GOx hay mayor producción de IgA para proteger el intestino. Por el contrario, la disminución del nivel de IgA por el uso de Bacillus y GOx podría estar relacionada con sus propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras, reduciendo las alteraciones morfológicas e inmunológicas intestinales mediante la expresión de las proteínas citoprotectoras y la modulación de diversas citocinas. 
 

Por otro lado, la FITC-d sérica aumenta con la inflamación y se considera un buen indicador para medir la permeabilidad intestinal inducida por la inflamación entérica en pollos de engorda. La reducción significativa (P < 0.05) del nivel sérico de FITC-d por Bacillus en comparación con el grupo control podría deberse al aumento de la regulación de las proteínas de unión estrecha. La molécula de FITC-d es de 3 a 5 kDa y, por lo tanto, no atraviesa la barrera del tracto gastrointestinal. Sin embargo, cuando se alteran las uniones estrechas epiteliales, la molécula FITC-d puede entrar en el torrente sanguíneo por el aumento de la permeabilidad transmucosa tras la administración oral de FITC-d. Varios estudios han confirmado que la inflamación intestinal puede ser inducida por ingredientes dietéticos o estrés, afectando así la permeabilidad intestinal. Es posible que al administrar Bacillus y GOx juntos en la dieta pudo inducir inflamación intestinal y alterar las proteínas de la unión estrecha, lo que permitió aumentar la permeabilidad intestinal y así las concentraciones de FITC-d en el suero. 

CONCLUSIONES

Los resultados generales del presente estudio sugieren que Bacillus y GOx pueden usarse para la prevención por la infección por S. Enteritidis, ya que tienen el potencial de reducir la colonización y mitigar sus efectos negativos en los pollos de engorda. Estos efectos podrían lograrse mediante mecanismos que podrían implicar la modulación de la microbiota intestinal y sus vías metabólicas. Los efectos de GOx contra S. Enteritidis a una dosis más alta (>100U/Kg) pueden revelar resultados más prometedores y actualmente están bajo evaluación. 

Aunque no se observaron diferencias significativas en la función inmune con la suplementación dietética de GOx o Bacillus, se observó una mejor ganancia de peso con el uso de Bacillus, y es importante destacar que se observaron efectos más beneficiosos en la composición de la microbiota intestinal con los tratamientos individuales en comparación con la combinación de GOx y Bacillus. Sin embargo, la eficacia de esta combinación y sus efectos en el intestino de los pollos sigue en investigación.
 

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