Jesús Adonai Maguey-González ¹, María de Jesús Nava-Ramírez ², Sergio Gómez-Rosales ³, María de los Ángeles Lourdes ³, Rubén Merino-Guzmán ⁶, Xochitl Hernández-Velasco ⁶, Alma Vázquez-Durán ², Abraham Méndez-Albores ² y Guillermo Téllez-Isaías ⁸
 

Resumen
 

En la presente investigación, se realizó la caracterización de ácidos húmicos (AH) aislados de lombricompostas mediante las técnicas de potencial Z (ζ), punto de carga cero (pHpzc), espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier con reflexión total atenuada (FTIR-ATR), microscopia electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de rayos X con dispersión de energía (EDS) para conocer la naturaleza de las interacciones físicas y químicas entre los AH y la molécula de aflatoxina B1 (AFB1), Adicionalmente se utilizó un modelo in vitro que simula el tracto digestivo de las aves de engorda para evaluar la capacidad adsortiva de AFB1. En la segunda parte del experimento se evaluó la eficacia de AH como adsorbentes de AFB1 en pavos que consumieron dieta contaminada con 250 ppb de AFB1 de alimento en términos de parámetros de rendimiento productivo, histopatología de intestino e hígado y permeabilidad intestinal. Los resultados de la caracterización revelaron que los grupos funcionales primarios en los AH son los ácidos carboxílicos y fenólicos. Además, se observó una superficie con una fuerte carga negativa en los pH simulados. El porcentaje de adsorción de AFB1 fue del 97.6% en comparación al 81.5% de la zeolita utilizada como referencia, en el modelo in vitro (P <0.05). En el modelo in vivo, la adición de AH mejoró el peso corporal (PC), la ganancia diaria de peso (GDP) y el índice de conversión alimenticia (CA). Además, los AH mitigaron eficazmente los efectos tóxicos causados por la AFB1 en la mayoría de las variables analizadas. Los resultados indicaron que los AH contrarrestaron eficazmente los efectos tóxicos inducidos por AFB1 en los pavitos. Con base en estos hallazgos, se puede concluir que los AH son capaz de eliminar la AFB1 de la dieta contaminada.
 

Palabras clave: Caracterización, Ácidos húmicos, AFB1, Aves de engorda
 

I.    INTRODUCCIÓN
 

La Aflatoxina B1 (AFB1), una micotoxina altamente tóxica producida principalmente por los hongos Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, representa una preocupación importante en la crianza de pavos, especialmente para los pavitos (polluelos de pavo) (1,2). La contaminación con aflatoxinas reduce la calidad del alimento y el rendimiento de los animales debido a una conversión deficiente de nutrientes (3). La aflatoxicosis en pavos se manifiesta como apatía, disminución del apetito, retraso en el crecimiento, utilización ineficiente del alimento, menor producción de huevos y mayor mortalidad. Además, la contaminación con aflatoxinas en el alimento puede afectar tanto la respuesta inmunitaria humoral como la celular, haciendo que las aves sean más susceptibles a agentes ambientales e infecciosos (4–6). Estudios previos han informado ampliamente sobre la presencia de cepas potencialmente productoras de aflatoxinas y moléculas de AFB1 en alimentos comerciales para pavos. En consecuencia, existe una necesidad urgente de métodos prácticos y rentables para descontaminar el alimento con aflatoxinas a gran escala (7). Se han empleado diversas técnicas físicas, químicas y biológicas para descontaminar productos agrícolas con buenos resultados, pero su implementación se ha visto limitada por la incertidumbre acerca de su efectividad in vivo (8). Un enfoque práctico es la utilización de materiales adsorbentes no nutritivos, que pueden unirse eficazmente a las micotoxinas e inhibir su absorción en el tracto gastrointestinal (9), reduciendo así su impacto tóxico en los pavos (10). Sin embargo, no todos los adsorbentes presentan una efectividad significativa, e incluso algunos pueden dificultar la utilización de nutrientes. Un adsorbente óptimo debe mostrar una alta afinidad por las aflatoxinas, facilitando la formación de complejos estables con un mínimo riesgo de disociación. Además, debe poseer una capacidad de unión considerable para evitar la saturación (11).
 

Las sustancias húmicas (HS) se encuentran ampliamente distribuidas en áreas en descomposición o sedimentación, como los suelos (12). Dentro de las HS, se distinguen tres componentes según su solubilidad: ácidos fúlvicos (AF), ácidos húmicos (AH) y humina (13). Estas sustancias han demostrado una fuerte capacidad para unirse a diversos compuestos, incluidos metales pesados, herbicidas, mutágenos, compuestos aromáticos, minerales y bacterias (14). Estudios recientes han demostrado que la incorporación de HS en las dietas de los pavos promueve el crecimiento al mejorar la digestibilidad de la energía y la retención de nutrientes (15,16). Aunque los mecanismos específicos detrás de este efecto promotor del crecimiento no se comprenden completamente, la inclusión de AH en la dieta del pollo aumenta la viscosidad intestinal y mejora su integridad (17,18). Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo preparar y caracterizar AH provenientes de lombricompostas, además de evaluar su capacidad absortiva en un modelo in vitro y su posterior uso en pavitos de engorda expuestos a una dieta contaminada con AFB1 por 28 días.
 

II.    MATERIALES Y METODOS
 

Ácidos húmicos
 

Tal como se describió previamente (19), los AH se extrajeron y aislaron a partir de una lombricomposta. La extracción se realizó empleando una solución de hidróxido de sodio (NaOH 1M) en una proporción composta: álcali de 1:4. La mezcla se agitó durante 2 horas. Una vez transcurridas 24 horas a temperatura ambiente, se filtró la suspensión utilizando un papel filtro Whatman grado 40. Posteriormente, se separó el sobrenadante por decantación tras centrifugar el filtrado a 3500 x g durante 15 minutos. El sobrenadante que contenían los AH se acidificó con HCl al 10% y se agitó continuamente hasta alcanzar un pH de 2, lo que permitió la precipitación de los AH. La separación de los AH de los ácidos fúlvicos se realizó mediante centrifugación a 3500 x g durante 15 minutos. Finalmente, el precipitado (AH) se neutralizó con NaOH 1M hasta alcanzar un pH de 10 y luego se secó en horno a 60°C, obteniéndose un polvo negro como resultado. 
 

Caracterización de los ácidos húmicos 
 

Los ácidos húmicos se caracterizaron mediante las técnicas de potencial Z (ζ), espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier con reflexión total atenuada (FTIR-ATR) y microscopia electrónica de barrido (SEM) previamente descritas (20).
 

Estudio In Vitro 
 

La capacidad adsorbente de los ácidos húmicos sobre la AFB1 se evaluó mediante un modelo in vitro que simula el tracto digestivo de las aves de engorda. En este modelo se simulan las principales condiciones fisiológicas (enzimáticas, temperatura y pH) del buche, proventrículo e intestino de las aves de engorda, con ligeras modificaciones (19). La dieta experimental utilizada fue a base de maíz-soya contaminada con 100 µg AFB1/kg. Se colocaron 5 g de alimento contaminado con AFB1 y 10 mg de cada material adsorbente en tubos de polipropileno de 50 mL. El proceso completo de digestión in vitro tomó 3 horas y 15 minutos. Posteriormente, se recolectó el sobrenadante de todos los tubos y se almacenó a -20°C para análisis posteriores tras centrifugarlos a 7000×g durante 30 minutos. Para determinar la concentración real de AFB1 en cada tubo, también se prepararon controles (sin la adición de materiales adsorbentes). Todo el experimento se realizó por quintuplicado.
 

Estudio In Vivo 
 

Se utilizaron un total de 350 pavitos hembra Nicholas-700 de 1 día de edad (Aviagen Inc., AR, USA) criados en corrales durante 28 días. Los pavitos se pesaron colectivamente (10 aves por corral) y se asignaron aleatoriamente a uno de los cinco grupos:
 

1. Control negativo (dieta basal)
2. Control positivo (dieta basal + 250 ppb AFB1)
3. AH (dieta basal + 0.25% de ácido húmico)
4. AH + AFB1 (dieta basal + AH + 250 ppb AFB1)
5. Zeolita + AFB1 (dieta basal + 0.25% zeolita + 250 ppb AFB1)
    

Cada grupo tuvo siete réplicas de 10 pavitos (n = 70). Se formuló una dieta a base de maíz y soya para pavitos que se aproxima a los requerimientos nutricionales recomendados por el NRC (17). La AFB1, los AH y la zeolita (adsorbente utilizado como referencia) se agregaron a la dieta y se mezclaron completamente hasta alcanzar el nivel especificado. Los pavitos se pesaron colectivamente cada semana para determinar el peso corporal (PC) y la ganancia de peso corporal (GPC), consumo de alimento (CA) e índice de conversión alimenticia (ICA). Adicionalmente, se tomaron muestras para histopatología de intestino e hígado y permeabilidad intestinal.  Todas las aves fueron sacrificadas el día 28 por inhalación de CO2.
 

 Cuantificación de AFB₁
 

Se utilizaron columnas de inmunoafinidad (Afla-B, Vicam, Watertown, MA, USA) para separar específicamente la AFB1 del resto de la muestra. El contenido de aflatoxinas se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con un método de detección por fluorescencia. La composición consistió en 86.82% AFB1, 8.22% AFG1, 4.55% AFB2 y 0.37% AFG2. Las dietas se analizaron para verificar la concentración real de AFB1.
 

Análisis estadísticos
 

Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de un factor (ANOVA de un factor) en un diseño completamente aleatorizado. Las diferencias significativas entre las medias se determinaron mediante la prueba de Tukey. Se utilizó un valor de α=0.05 para detectar diferencias significativas entre los tratamientos.
 

III.    RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 

Caracterización
 

En general, los espectros FTIR-ATR mostraron que los AH contienen una amplia variedad de grupos funcionales ácidos como carboxílicos, carbonilos, hidroxilos y fenólicos (dominios hidrofílicos), así como grupos alifáticos, aromáticos y metilo (dominios hidrofóbicos) (Cuadro 1). Estos grupos funcionales se consideran sitios potenciales para la unión de contaminantes (12,21), y para la formación de complejos con ciertos cationes metálicos (14). Otros estudios indican que los grupos fenólicos asociados a OH, C-O, C=O forman enlaces de hidrógeno con ciertos compuestos orgánicos e inorgánicos (22–24). Por ejemplo, Vázquez-Durán et al (2021) indicaron que el OH podría establecer enlaces de hidrógeno con los átomos de oxígeno en los grupos metoxi, carbonilo y éter de la molécula AFB1.
 

La morfología de la superficie y la microestructura de los AH se evaluaron utilizando una serie de imágenes por medio de una SEM (Figura 1). La superficie de los AH es rugosa e irregular con la presencia de agregados de la misma molécula en diversas formas y tamaños. La mayoría de las partículas tienen un tamaño de aproximadamente 163,42 ± 20,14 μm. Además, se observaron surcos en la superficie de las partículas con trazas de gránulos. Estos resultados son consistentes con la estructura granular de varios AH extraídos de diversas fuentes (26,27). La composición física y química de AH difiere según su fuente, las condiciones ambientales y el procedimiento de extracción (21,28,29). Asimismo, diversas variables, como la concentración, el pH, la fuerza iónica, el grado de ionización de los grupos ácido y las interacciones intermoleculares, influyen en la conformación estructural de los AH (13,30). La estructura de los AH se protona a un pH inferior a 4, lo que da como resultado una estructura agregada. Mientras que la carga superficial es casi nula a niveles de pH entre 4 y 6, lo que reduce la repulsión intramolecular, promoviendo una macroestructura más expandida y dispersa (26). A pH superior a 7, se puede observar una estructura abierta y desplegada completamente (Klučáková, 2017). 
 

En los sistemas coloidales, el potencial ζ se emplea con frecuencia para conocer el comportamiento de las partículas suspendidas en un líquido. Además, la magnitud del potencial ζ indica la fuerza de la atracción o repulsión electrostática entre partículas; por lo tanto, puede usarse para describir la superficie de partículas cargadas (32,33). Los valores de pH que se utilizaron para la determinación del potencial ζ fueron 2, 5 y 7, cada uno de acuerdo con el compartimento simulado (buche, proventrículo e intestino) en el modelo in vitro (Figura 2). El valor del potencial ζ se vuelve más negativo a medida que aumenta el pH, de -46,44 mV, -50,16 mV a -54,46 mV. Nuestros hallazgos son consistentes con los informados por Hamza et al (2019), quienes afirman que a medida que aumenta el pH, los grupos funcionales ácidos de los AH se desprotonan, lo que da como resultado una superficie más negativa. (22,35). Las variaciones en la conformación de los grupos ácidos pueden usarse para explicar cómo las interacciones dependen del pH (31). Se reconoce que la primera disminución (pH 3) del potencial ζ corresponde a la disociación de los grupos ácido carboxílico, mientras que la segunda (pH 6) corresponde al inicio de la ionización de los grupos ácido fenólicos (36). Nuestros hallazgos muestran que los AH tienen un potencial ζ altamente negativo en los tres compartimientos del modelo in vitro, particularmente a pH 7. Como resultado, la molécula de la AFB1 y la superficie de los AH podrían interactuar por fuerzas electrostáticas, ya que los AH son polielectrolitos aniónicos que pueden interactuar con las moléculas AFB1 cargadas positivamente (34,37,38).
 

Estudio In Vitro 
 

Respecto al porcentaje de adsorción de AFB1 en el modelo in vitro. Los AH tuvieron una capacidad adsortiva del 97.6%, en comparación al 81.5% de adsorción de una zeolita utilizada como control (Figura 3). Comparando nuestros resultados, en un estudio in vitro con 100 mg/ml de inclusión de AH y un reto de 20 ppb de AFB1, se observó una adsorción de AFB1 del 90.50 % (39). Además, Ye et al (2009) investigó la capacidad adsortiva de AFB1 en presencia de diferentes niveles de AH, bajo diversos niveles de pH, tiempos de interacción y concentraciones de AFB1. Reportando, que los mayores porcentajes de adsorción fueron 88.12 % a pH 7 y 76.36 % a pH 8. 
 

Estudio In Vivo 
 

El cuadro 2 resume las diferencias en el peso corporal (PC), la ganancia de peso corporal (GPC), el consumo de alimento (CA) y el índice de conversión alimenticia (ICA) en pavitos que consumieron una dieta a base de maíz-soya contaminada con aflatoxina B1 (AFB1) (250 ppb de AFB1) suplementada con AH. a los 28 días, el PC de ambos tratamientos con AH (637.47 y 571.95 g para AH y AH + AFB1, respectivamente) fue mayor que el de los tratamientos con AFB1 (428.14 g) (P<0.0001). Al comparar el período de 0 a 28 días, la GPC de ambos tratamientos con AH se mantuvo significativamente más alta (581.13 y 515.25 g para AH y AH + AFB1, respectivamente) en comparación con el tratamiento control positivo (371.76 g) (P<0.0001). Respecto al CA de 0 a 28 días, fue significativamente mayor en ambos tratamientos con AH (764.04 y 706.76 g para AH y AH + AFB1, respectivamente) en comparación con el tratamiento control positivo (141.75 g) (P<0.0001). Finalmente, el ICA de 0 a 28 días fue significativamente mayor en el control negativo (1.56), control positivo (1.52) y ZEO + AFB1 (1.51) en comparación con ambos tratamientos con AH (1.31 y 1.37 para AH y AH + AFB1, respectivamente) (P<0.0001), lo que indica una mejor ICA en los tratamientos suplementados con AH. En general, los pavitos suplementados con HA mostraron un aumento en el PC, la GPC, el CA y el ICA. Estos resultados son consistentes con hallazgos previos en pollos de engorde suplementados con sustancias húmicas derivadas de lombricomposta donde se observó una mejora en los parámetros productivos (15,41).
 

El cuadro 3 resume las respuestas de degeneración hepatocelular en pollos de engorde que consumieron dietas contaminadas con AFB1 y suplementadas con AH. El tratamiento control positivo (AFB1), mostró aumentos significativos (P < 0.05) en la degeneración celular y vacuolar, y fibrosis en comparación con el control negativo. En los pollos tratados con AH, se encontró una menor congestión vascular (P < 0.05) en comparación con los grupos control positivo y negativo, y una menor hiperplasia de los conductos biliares en comparación con el grupo control positivo. El agrandamiento y aumento de peso observados en el hígado pueden atribuirse a una acumulación de lípidos, lo que conduce a una condición conocida como hígado graso friable en pollos afectados por aflatoxicosis (42). Adicionalmente, se cree que la respuesta inflamatoria es un mecanismo mediante el cual el organismo responde a la degeneración y vacuolación de los hepatocitos causada por la exposición a AFB1 (43).
 

Los resultados del efecto de AH sobre el análisis morfométrico y los niveles séricos de dextrano de isotiocianato de fluoresceína (FITC-d) en pavitos que consumieron una dieta contaminada con 250 ppb de AFB1 durante 28 días se resumen en el cuadro 4. Los pavitos en los tratamientos NC, AH y AH + AFB1 mostraron un aumento significativo en la altura de las vellosidades, seguido de los pavitos en el tratamiento ZEO + AFB1. Por el contrario, el tratamiento PC mostró la altura de vellosidades más baja. Los pavitos en los tratamientos NC y AH + AFB1 mostraron el área total más alta, seguidos de los pavitos suplementados con AH y ZEO + AFB1. Mientras tanto, el tratamiento PC tuvo el área total más baja y mostró la concentración sérica más alta de FITC-d en comparación con el resto de los tratamientos experimentales. El aumento de la altura y el ancho de las vellosidades, indicadores de una mejor absorción de nutrientes, corrobora los hallazgos de Taklimi et al. y López-García et al. (44,45). De manera similar, la reducción de la permeabilidad intestinal coincide con los resultados presentados por Maguey-Gonzalez et al. (17), lo que sugiere la capacidad de los AH para fortalecer la barrera intestinal y prevenir la absorción de AFB1.
 

IV.    CONCLUSIONES
 

En la primera parte de este estudio, se puede concluir que los AH derivados de lombricomposta son altamente efectivos en la adsorción de AFB1 en un modelo in vitro. En la segunda parte del presente estudio se confirma que la exposición a 250 ppb de AFB1 durante 28 días indujo una toxicidad severa en los pavitos, afectando el rendimiento y en general la salud de las aves. Adicionalmente, el uso de AH como aditivo alimentario en dosis relativamente bajas demostró su eficacia en la mitigación de la toxicidad de la AFB1. Estos resultados sugieren que los AH derivados de las lombricompostas pueden ser una herramienta preventiva eficaz para proteger a los pollos de engorde de los efectos nocivos del AFB1, contribuyendo a mejorar su salud intestinal y bienestar general.
 

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