En la actualidad el desgaste en los recursos zoogenéticos, es decir la fauna utilizada para en beneficio alimentario principalmente hacemos referencia al ganado bovino, ovino, porcino, aviar; por mencionar algunos se hace más notorio debido que en tiempos recientes se han presentado epidemias tal como la ocurrida en 2018 por el SARS COVID-19, conflictos bélicos actuales, además del persistente cambio climático, la resistencia a patógenos, y poniendo un punto final con el cruzamiento indiscriminado, que aunado al escaso control de la endogamia; provoca está perdida en la  variabilidad genética dentro de las poblaciones de ganado, de ahí que surge la necesidad de disponer de material genético “ex situ” e “in vitro”, el cual se habrá de conservar en bancos de germoplasma los cuales tiene como finalidad colectar material genético tal como espermatozoides, ovocitos, embriones, y en especial células  somáticas, para de esta forma evitar que se afecten los sistemas de producción pecuaria (Castro, 2007; FAO, 2020; Sponenberg, 2012; Zavala, 2021).

Desde el punto de vista productivo, se debería realizar un seguimiento de cómo es que van evolucionando estas poblaciones, lo cual sería un paso principal para una actuación pronta y eficaz y así poder salvar las razas de la extinción. Debido a que la erosión de la diversidad intrarracial pudiera convertirse en un problema a corto plazo, incluso en razas con elevados números de ejemplares. Hoy en día diversas naciones actualmente trabajan en la conservación de razas tanto puras como autóctonas de animales productivos, esto con la finalidad de la conservación de sus propios recursos zoogenéticos, priorizando de esta forma el uso sustentable. Tal es el caso de España, que cuenta con bancos de germoplasma promovidos por las asociaciones de criadores de razas puras autóctonas locales, al  igual que EE.UU. y México siguen estos ejemplos. FAO, 2020. “Las acciones para evitar la pérdida de diversidad ganadera serán más eficaces cuanto mejor se comprendan los factores que conducen a la erosión genética y al riesgo de extinción” (Sponenberg, 2012;  Zavala, 2021).

Bajo el concepto de utilización y máximo aprovechamiento de los recursos al alcance de la investigación y, con la finalidad de obtener resultados benéficos para la preservación, se han desarrollado biotecnologías de la reproducción animal asistida, tal como la Transferencia Nuclear de Células Somáticas (TNCS). Técnica que consiste en insertar el núcleo de una célula somática a un ovocito enucleado, fusionada mediante impulsos eléctricos, teniendo que el embrión resultante será una réplica genética del ejemplar que dono su célula somática (Jiang et al., 2011; Seaby et al., 2013; Saini et al., 2018; Galli et al., 2021).

El uso de las biotecnologías reproductivas como herramienta de expansión de poblaciones toma una especial importancia cuando se tiene un número crítico y reducido de individuos pertenecientes a dichas poblaciones, además de su aplicación en la preservación de individuos cuyas características rebasan la media de sus congéneres (Lagutina et al., 2013; Galli et al., 2021; Mrowiec et al., 2021).

En la actualidad sabemos que la TNCS tiene diversas aplicaciones, y aunque algunas son prometedoras, otras pudieran llegar a ser controvertidas. 

1. Obtención de Órganos para Trasplantes:

Uno de los usos más prometedores de la técnica es el obtener órganos viables para trasplantes en seres humanos, se piensa que en un futuro el humano podría cultivar órganos específicos en animales clonados (cerdos), y luego utilizar esos órganos para trasplantar, se sabe que fisiológicamente  órganos de cerdos son  compatibles con los humanos.

2. Conservación de Especies en Peligro de Extinción:

La clonación ofrece una esperanza para especies en peligro de extinción, se han realizado avances. Por ejemplo, en 2003, se clonó un bucardo (una especie de cabra montés) que estaba extinto, aunque lamentablemente murió poco después del nacimiento. 

Producción de Alimentos y Ganadería:

La clonación también se utiliza en la producción de alimentos, pudiendo entonces clonar animales de producción para obtener carne de alta calidad y mayor rendimiento. Además, en el ámbito de la ganadería, la TNCS se centra en producir animales altamente rentables. 

De tal forma en el presente trabajo nos planteamos la pregunta de ¿Qué efecto tendrá el uso de citoplastos de ovino en la fusión con carioplastos bovinos sobre la producción y desarrollo in vitro de embriones por TNCSI?. Se genero como hipotesis:  dado que el ovocito contiene toda la información necesaria para la producción de un embrión, el uso de citoplastos de ovino permitirá la fusión, activación y desarrollo in vitro de embriones clonados por TNCSI, a partir de carioplastos de bovino adulto. Teniendo como principal objetivo el generar embriones clones de bovino mediante la TNCSI, a partir de citoplastos de  ovino y carioplastos de bovino.

El trabajo experimental fue dividió en 3 partes la primera para la generación de cultivos primarios se utilizarán muestras de piel de 0.3cm2, obtenidas de ejemplares cuya calidad genética sea demostrada y superior a la media de la población (Simbrah propiedad del CIPA-UANL). Para la obtención de cultivos en cajas de Petri de 35 mm se agregarán 3 mL de medio de cultivo adicionado con 1μg/mL de EGF (Navarro-Maldonado et al., 2015). Las muestras se incubaron en las condiciones siguientes (condiciones de incubación: 38.3 °C, 90% N2, 5% O2, 5% CO2 y humedad a saturación) y fueron monitoreadas a las 24 y 48 h después de su siembra. Se mantuvieron en condiciones similares hasta alcanzar la confluencia (presencia celular >90% del crecimiento en la caja de cultivo), las células se despegaron de la matriz extracelular y de la base de la caja utilizando 1 mL de Tripsina-Verseno por 10 minutos, posterior se detuvo la acción de las enzimas con medio suplementado con suero fetal bovino en partes iguales. La segunda fase consistió en la obtención de complejos cumulus-ovocitos (CCO) mediante punción de tejido ovárico de ovinos de rastro, posteriormente se realizo lavado y selección de los CCO con mayores cantidades de células del cumulus, los cuales fueron puestos a maduración in vitro durante 20 a 22 hrs en medios de maduración comercial. 

Tercera fase (TNCS).  Completada la MIV, los COC son denudados hialuronidasa (Sigma-Aldrich) en solución (0.5 mg/mL), se seleccionaron los ovocitos que presentaron extrusión del primer cuerpo polar (1er CP), es decir aquellos ovocitos que se arrestaron en la fase meiótica MII para la enucleación manual de ovocitos una micronavaja, bajo el microscopio estereoscópico (Olympus SZ61). La unión de citoplastos y carioplastos de bovino se realizó en la cámara de fusión (BTX microslide, 0.5 mm de apertura). Para su cultivo se utilizó el sistema celda sobre celda (en inglés Well of Well), que consistió en hacer micropozos en una de las celdas de una caja de cuatro celdas, de acuerdo con el número de clones formados por electrofusión.
 

Los resultados que se obtuvieron durante las repeticiones de estos experimentos fueron los que se expresan en la Tabla 1, donde se hace un comparativo entre los grupos control y tratamiento, y los grados de desarrollo embrionario que alcanzaron. 

Se efectuó la tinción DAPI para observar los núcleos de los blastómeros de los embriones clones. De los 15 embriones clones en estado de mórula 8 (53%) tuvieron 12 blastómeros con núcleo, 3 (20%) tuvieron 14 blastómeros y 4 (27%) 16-18 blastómeros (Figura 4). Además, se evidencio el grado de fragmentación de los embriones clones, mostrando la presencia de blastómeros anucleados y multinucleares, (Figura 5), confirmando que de los 27 (45%) embriones fragmentados: 8 (30%) tuvieron presencia de blastómeros polinucleares, 15 (55%) estaban con núcleos picnóticos y 4 (15%) anucleados. 
 

Al observar los resultados obtenidos, y analizando el máximo desarrollo embrionario como era de esperarse las tasas de embriones clones así como de partenogenéticos con fragmentación fueron elevadas, hasta 45%, lo cual es coincidente con lo reportado por Vázquez-Avendaño 2016, debido a que las metodologías para la clonación así como la de embriones partenogenéticos, incluyen pasos que forzan el desarrollo embrionario. Mrowiec et al, 2021; Adams et al, 2022 han señalado que la fragmentación es elevada durante la clonación de embriones, debido a que esta supone la asincronía en el desarrollo y división tanto nuclear como citoplasmático, dando como consecuencia blastómeros anucleados o polinucleados (Figura 4). el DIV de los embriones clones fue limitado, al respecto Tecirlioglu et al, 2006 y Lagutina et al, 2011, reportaron que, la máxima etapa de desarrollo alcanzada por embriones clones obtenidos mediante TNCSI a partir de citoplastos de ovino y carioplastos de bovino, es la mórula de 16 células, tal y como se obtuvo en el presente trabajo.
 

En relación a este detención del desarrollo embrionario que presentan los embriones clones (mórula de mínimo 16 células) Jiang et al, (2011) y Selokar et al, (2011), lo explican a través de que el mantenimiento del genoma mitocondrial recae sobre una de las dos especies participantes en la clonación, por lo que, la fusión, activación y desarrollo de células pertenecientes a dos especies divergentes genéticamente tiene necesariamente un desarrollo embrionario bajo. 

Por otro lado Malin et al, 2022, mencionaron que, cuando entre las células donadoras de núcleo y los ovocitos receptores en la TNCSI hay una relación taxonómica muy distante (entre clase, orden, familia y género de especie), solo se consiguen desarrollos embrionarios en etapas iniciales y precisan que el paso es contrario cuando las especies donadoras y receptoras del carioplasto, son de una cercanía taxonómica en la fisiología reproductiva, tipo de placentación y tiempos de gestación, es decir el desarrollo embrionario esperado será hasta blastocisto Se ´pudo concluir que la actividad fisiológica de las células obtenidas “in vitro”, en cuanto a la característica de totipotencialidad quedo expuesta mediante la TNCSI llevada a cabo, a pesar de que no son células especie especificas pudimos constatar que su funcionalidad y posibilidad de empleo en la técnica es viable, comportándose de la misma manera las células de los rumiantes empleados (bovino y ovino), aunque para conocer el comportamiento de las células requiere del uso de citoplastos y carioplastos especie específicos en este caso de bovino para lograr embriones transferibles y con ello conservar el material genético de ejemplares seleccionados.

Bibliografía relevante 

- Adams, L; Liu, Y; Durrant, B; Ruggeri, E; Young, C; Krisher, R; Polejaeva, I (2022). Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte. J Vis Exp. 6;(185).

- Castro, R (2007). Establecimiento de un banco genético de células fibroblasticas de un ejemplar Güiña (Oncifelis guigna). Tesis de licenciatura Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Escuela de Ciencias Veterinaria, Santiago, Chile. 72p.

- FAO (2020). La situación de los recursos zoogenéticos mundiales para la alimentación y la Agricultura, editado por Barbara Rischkowsky y Dafydd Pilling.    Roma    (disponible    en http://www. fao.org/docrep/011/a1250s/a1250s00.htm).

- Jiang Y; Kelly R; Peters A; Fulka H, Dickinson A; Mitchell D; St. John, J (2011). Interspecies Somatic Cell Nuclear Transfer Is Dependent on Compatible Mitochondrial DNA and Reprogramming Factors. Plos One 6(4): e14805.

- Lin L; Hua Y; Jianzhang M; Wei-jun G; Yue-hui M (2009) Establishment and characterization of a fibroblast line from Simmental cattle. Cryobiology 59: 63–68.

- Malin, K; Witkowska, O; Papis, K (2022). The many problems of somatic cell nuclear transfer in reproductive cloning of mammals. Theriogenology 189: 246e254.

- Mrowiec, P; Bugno, M; M?odawska, W (2021). The perspective of the incompatible of nucleus and mitochondria in interspecies somatic cell nuclear transfer for endangered species. Reprod Domest Anim; 56(2):199- 207.

- Navarro-Maldonado, M; Hernández, S; Martínez J; Vázquez, R; Ambríz, D; Rangel, R; Vajta G (2016). Clonación de Embriones de Ovis aAries utilizando fibroblastos criopreservados durante 14 meses. Revista Iberoamericana de Ciencias. Vol. 3 No. 4., pp 45-53.

- Selokar, N; George, A; Saha, A; Sharma, R; Muzaffer, M; Shah, R; Palta, P; Chauhan, M; Manik, S ; Singla S (2011). Production of interspecies handmade cloned embryos by nuclear transfer of cattle, goat and rat fibroblasts to buffalo (Bubalus bubalis) oocytes. Animal Reproduction Science123: 279–282

- Seluanov, A; Vaidya, A; Gorbunova, V (2010). Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, DOI : 10.3791/2033

- Sponenberg D (2012). La pureza racial y la conservación de recursos criollos en los Estados Unidos. Actas Iberoamericanas de Conservación Animal 2: 35-41.

- Tecirlioglu, T; Gu, J; Trounson A (2006). Interspecies Somatic Cell Nuclear Transfer and Preliminary Data for Horse-Cow/Mouse iSCNT. Stem Cell Reviews, 2(4): 277-287.

- Vázquez-Avendaño, R (2016). Reprogramación de carioplastos con extractos de ovocitos como estrategia de producción de embriones por handmade cloning en Ovis aries, Tesis de Maestria, Universidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de México, 86p.

- Zavala M (2021). Los recursos zoogenéticos, ¿Qué son y cuál es su importancia?
ttps://www.sabermas.umich.mx/archivo/articulos/14- numero-2/30-los-recursos-zoogeneticos-ique-son-y-cual-es-su- importancia.html.