Resumen
 

La inseminación artificial (IA) es crucial en la industria porcina para satisfacer la demanda de proteína animal, pero la contaminación bacteriana durante la recogida de semen de verraco es un desafío común. Los diluyentes comerciales contienen antibióticos para combatir bacterias como E. coli y S. aureus, asegurando la calidad del semen y la eficacia de la IA. Sin embargo, el uso excesivo de antibióticos ha causado resistencia bacteriana, reduciendo su efectividad y planteando un desafío para la industria. Las nanopartículas de oro (AuNPs) han emergido como alternativas prometedoras debido a sus propiedades antimicrobianas, siendo inferiores a 100 nanómetros y con una gran superficie. Se empleó la síntesis verde utilizando extractos de chile Yahualica (Capsicum annuum L.), conocidos por sus propiedades antioxidantes para sintetizar las AuNPs. Se evaluó el impacto de las AuNPs en la motilidad total (MT), progresiva (PR) y vitalidad espermática en semen diluido de verraco conservado a 17°C. Se desarrolló un diseño de medidas repetidas con tres cerdos cruza York/Landrace x Pietrain, tres concentraciones de AuNPs, AgNPs y extracto de chile Yahualica: 1.0 µL (T1), 1.25 µL (T2), 1.50 µL (T3), y controles de diluyentes BTS y BTSS, durante seis semanas, analizados con PERMANOVA al 95% de confianza. Las AuNPs mantuvieron una MT del 70% con PR de 40% y vitalidad de 80% a las 72 horas (P<0.05), mientras que el extracto de chile Yahualica mantuvo una MT del 80% con PR de 40% pero vitalidad de 60% a las 72 horas. Estos hallazgos sugieren que la incorporación de AuNPs en muestras de semen de cerdo conservado a 17°C ofrece una alternativa efectiva al uso de antibióticos.
 

1. Introducción
 

En la última década, la producción de carne de cerdo ha crecido para satisfacer la alta demanda global de proteínas asequibles. La inseminación artificial (IA) ha incrementado la eficiencia y rentabilidad en la cría de cerdos. Sin embargo, la IA enfrenta problemas como la presencia de sustancias oxidantes en el semen y la contaminación bacteriana, lo que afecta la viabilidad del semen.
 

El uso de diluyentes ayuda a mantener el semen viable, y se están explorando alternativas naturales a base de extractos de plantas para mejorar la conservación y la motilidad espermática. No obstante, la adición de antibióticos a los diluyentes ha generado bacterias resistentes, lo que ha llevado a investigar métodos alternativos, como el uso de nanopartículas metálicas con actividad antibacteriana.
 

En esta investigación, se propuso la síntesis de nanopartículas de oro funcionalizadas con extractos de chile Yahualica Capsicum annuum L. para conservar muestras de semen fresco a 17°C, aprovechando sus propiedades antimicrobianas.
 

2. Materiales y métodos
 

2.2 Obtención de extractos naturales 
 

El chile Yahualica (Capsicum Annuum L.) se adquirido de forma comercial; este fue macerado 10 días en una solución hidroalcohólica en proporción 7:3. El extracto acuoso fue filtrado y colectado en un recipiente de vidrio estéril, y almacenado en refrigeración a 4°C. Se determinó su potencial antioxidante mediante técnicas para la detección de grupos fenólicos.
 

2.3 Síntesis de nanopartículas de oro (AuNPs)
 

El método para la biosíntesis de las AuNPs se realizó preparando una solución de 3 mM de ácido tetracloroaurico (HauCl4) en 10 mL de agua bidestilada, agregando 400 μL del extracto de Capsicum annuum L. previamente obtenido, hasta que la mezcla adquirió una coloración purpurea. 
 

La manera de determinar la presencia de nanopartículas en la solución coloidal de oro fue por medio de estudios de espectroscopia ultravioleta visible, y para la determinación de tamaño y forma de las partículas, se utilizó microscopía electrónica de transmisión, y dispersión dinámica de luz.
 

2.4 Análisis de viabilidad seminal
 

2.4.1SQS (Semen Quality System):
 

Equipo portátil para analizar la viabilidad del semen de verracos, diferenciando células vivas y muertas mediante tinción fluorescente y una cámara CMOS de alta resolución. Emite informes con cálculos de dosis.
 

2.4.2 CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis):
 

Herramienta para evaluar la calidad espermática en reproducción animal, eliminando el sesgo de la microscopía convencional. Utiliza una cámara de alta resolución y genera informes sobre movilidad, morfología, concentración y viabilidad espermática.
 

2.5 Pruebas antimicrobianas para AuNPs
 

Se analizó la actividad antimicrobiana que presentan las AuNPs por medio de difusión en pozos, Ensayo de microdilución en pozos para la evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) con rezasurina Ensayo para obtener Concentración Mínima Bactericida (MBC).
 

2.6 Diseño experimental
 

Para los parámetros de motilidad total (MT) y motilidad progresiva (PR), se desarrolló un diseño de medidas repetidas en función del tiempo con tres cerdos cruza York/Landrace x Pietrain, tres concentraciones de AuNPs, y extracto de chile Yahualica: 1.0 µL (T1), 1.25 µL (T2), and 1.50 µL (T3), y dos controles, diluyentes comerciales BTS y BTS sin antibiótico (BTSS), durante seis semanas. Todos los análisis estadísticos se realizarán al 95% de confianza (α = 0.05), mediante el uso de R Studio 4.2.3 (R Core Team, 2023). Se hizo un análisis multivariado permutado de la varianza (PERMANOVA). 
 

Para el caso de la vitalidad espermática, se desarrolló un diseño de similar al anterior a una sola concentración de AuNPs, y extracto de chile Yahualica: 1.50 µl (T), y dos controles, diluyentes comerciales BTS y BTS sin antibiótico (BTSS). Para ambos se incluyó análisis distancias Bray curtis y 10,000 permutaciones. Se analizaron los tratamientos, las horas y la interacción tratamientos*horas con respecto a motilidad para cada uno de los tratamientos con nanopartículas.
 

Finalmente, para evaluar la integridad acrosomal, se desarrolló un diseño de medidas repetidas en función del tiempo a una sola concentración de AuNPs, y extracto de chile Yahualica: 1.50 µl (T), con 2 controles, diluyentes comerciales BTS y BTS sin antibiótico (BTSS) a una sola semana.  Se realizó una prueba Chi-cuadrada de bondad de ajuste. Se analizaron los tratamientos (Nanopartículas y controles) con respecto al porcentaje de daño acrosomal para cada una de los tratamientos
 

3. Resultados
 

3.1 Efecto de las AuNPs sobre la motilidad espermática
 

En la presente investigación se encontró que las AuNPs mantuvieron una MT hasta del 80% a las 48 horas y más del 70% a las 72 horas siendo ambas equiparables a los controles, con diferencias significativas paras todas las horas. 
 

Por otro lado, el extracto de Capsicum annuum L. mantuvo una motilidad total hasta del 80% a las 48 y 72 horas superiores a los resultados de los grupos controles con diferencias significativas (P<0.05) paras todas las horas; sin embargo, no hubo diferencias significativas (P>0.05) entre los 3 tratamientos de Capsicum annuum L. aplicados a las muestras.
 

En el caso de la motilidad progresiva, para las AuNPs esta se mantuvo por arriba del 40% superior a los controles, y a las 72 horas esta se mantenía por arriba del 30% equiparable a los controles siendo estadísticamente significativo (P<0.05) para todas las horas, pero no para los distintos tratamientos de AuNPs; mientras que el extracto de Capsicum annuum L. mantuvo una progresiva de hasta 40% de las 48 a las 72 horas superiores a los resultados de los grupos controles con diferencias significativas (P<0.05) paras todas las horas; sin embargo, no hubo diferencias significativas (P>0.05) entre los 3 tratamientos de Capsicum annuum L. aplicados a las muestras.
 

Los resultados del presente estudio demostraron que el extracto hidroalcohólico del Capsicum annuum L. mantuvo una vitalidad mayor al 80% a las 48 horas y más del 60% a las 72 horas, siendo ambas superiores a los controles con diferencias significativas (P<0.05) paras todas las horas. En el caso de las AuNPs, estas mantuvieron una vitalidad del 80% durante las 48 y 72 horas con diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) entre ambos tratamientos, siendo las AuNPs superior a los controles. 

En el Cuadro 4 se muestran los resultados del análisis de integridad acrosomal del espermatozoide en interacción con el extracto de Capsicum annuum L., BTS y BTSS no se observaron diferencias (P>0.05) con relación a los acrosomas dañados. En adición, se puede comentar que el uso de AgNPs y AuNPs no mostro diferencias significativas en la integridad acrosomal del espermatozoide con respecto a los controles.

Para analizar la síntesis de las NPs, se observó el corrimiento de los picos de máxima absorbancia o el ancho de las curvas, ya que, cambios en estas están relacionados con la formación de agregados de partículas conforme transcurre el tiempo. El espectro de absorción se registró de 300 a 800 nm y la generación de picos característicos se observó a los 537 nm. Para corroborar el tamaño y morfología de dichas AuNPs biosintetizadas, se llevó a cabo el análisis mediante TEM. En la Figura 3 se muestran las imágenes obtenidas mediante TEM. La barra de escala (50 y 200 nm) permitió determinar que, el tamaño de las partículas fue menor a los 100 nm.
 

Existen estudios como el realizado por Lomelí et al., (2022), dónde abordan la síntesis de NPs mediante extractos de las plantas del género Capsicum mediante el uso de radiación UV. En su estudio, estos autores demostraron que distintas partes de la planta de este género fueron capaces de reducir NPs de oro y plata con absorbancias de 552 nm y 430 nm respectivamente, manteniendo su estabilidad hasta por 60 días. Las diferencias encontradas entre estos valores son debido a que los compuestos bioactivos presentes en las plantas actúan como agentes reductores que ayudan en la reducción de iones metálicos a nanopartículas metálicas con tamaños y formas diferentes (Ahmed et al., 2016; Smitha, 2008).
 

3.4 Evaluación de actividad biológica de nanopartículas
 

Se realizó un estudio cualitativo para observar la actividad antibacteriana frente a un número específico de UFC / g con un tiempo definido por contacto cuando, las bacterias se encuentran en una fase de crecimiento activo. La inhibición de las AuNPs se llevó a cabo en cepas de importancia clínica de E. coli y S. aureus mediante el método de difusión en pozos. Las AuNPs mostraron halos de inhibición de 0.45 cm para E. coli y 0.56 cm para S. aureus lo cual coincide con lo reportado por Vanaraj et al., 2017 y Boomi et al., 2020. Posteriormente se analizó la dosis mínima inhibitoria (MIC) contra E. coli, mostrando actividad inhibidora microbiana en todas las repeticiones ensayadas. Sin embargo, no todas las concentraciones de las AuNPs mostraron la capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano. 
 

Finalmente, la dosis mínima bactericida (MIB) para las AuNPs fueron probadas a partir de la MIC utilizando una cepa de E. coli. Se analizaron a partir de la dosis mínima inhibitoria (MIC) hacia la izquierda (dónde la dosis de AuNPs es mayor). La inhibición de las AuNPs se llevó a cabo en una cepa de E. coli el método de extensión de placa con aza triangular. Las AuNPs mostraron actividad inhibidora microbiana contra E. coli a partir de la dosis de 1.18x10-³ mg/ mL de la solución de nanopartículas de oro en contrastase con estudios en los que particularmente la biosíntesis de AuNPs funcionalizadas con extractos de tallos y hojas de plantas del genero Capsicum (Lomelí et al., 2022), donde las AuNPs contra cepas de E. Coli y S. aureus no presentaron inhibición bacteriana independientemente de las cepas ensayadas
 

3.5 Compuestos antioxidantes del chile Yahualica (Capsicum annuum L.)
 

Los resultados de las pruebas cualitativas del extracto de chile Yahualica confirmaron la presencia de diferentes metabolitos secundarios. Estas sustancias contenían fenoles, taninos, flavonoides (Cuadro 5). Los fenoles, taninos, carbohidratos y glucósidos fueron dominantes en el extracto de chile Yahualica. En cambio, el extracto no incluía metabolitos como proantocianidinas.
 

Este contiene cantidades considerables de compuestos fenólicos cuyo potencial antioxidante ya han sido reportados por otros autores como Denev et al., (2019), con contenidos desde 42 mg/100 g de materia seca, en tanto que en el presente estudio tiene hasta 9 mg/10 g de materia seca, variando esto debido a los métodos de extracción utilizados.
 

4. Conclusiones 
 

El extracto acuoso de chile Yahualica (Capsicum annuum L.) contiene compuestos fenólicos y flavonoides que le confiere un gran potencial antioxidante.
 

El potencial antioxidante del extracto acuoso de chile Yahualica (Capsicum annuum L.) reduce iones de oro a nanopartículas con diámetros menores que 100 nm, y mantiene la estabilidad de dichas nanopartículas hasta por 1 mes.
 

Las AuNPs funcionalizadasas con extractos de chile Yahualica (Capsicum annuum L.) tienen actividad antimicrobiana contra cepas de E. coli y S. aureus, además de un potencial bactericida contra E. coli a dosis de 1.18x10-3 mg/ mL de la solución de nanopartículas de oro.
 

El uso de AuNPs funcionalizadas con extractos de chile Yahualica (Capsicum annuum L.) mantiene la motilidad espermática mayor a 80% durante 48 horas, en 70% a las 72 horas, y hasta con 40% de motilidad progresiva en dosis de semen conservado a temperaturas de 17°C el semen de cerdo con concentraciones de hasta 1.25 µl/ mL de solución de AuNPs.
 

La vitalidad de las dosis de semen de cerdo diluido conservado a 17° C se mantiene en un 80% hasta las 72 horas post tratamiento con dosis a una concentración 1.25 µl/ mL de solución de AuNPs, sin daño significativo a nivel acrosomal.
 

El uso de extractos de chile Yahualica (Capsicum annuum L.) puede mantener la vitalidad de dosis de semen conservado a temperaturas de 17°C de cerdo en 80% durante 48 horas y hasta 60% a las 72 horas con una concentración 1.25 µl/ mL de solución de AuNPs, sin daño significativo a nivel acrosomal con dosis con una concentración 1.25 µl/ mL de extracto hidroalcohólico.
 

Cabe mencionar que el uso de la nanotecnología en las ciencias veterinarias es un campo en creciente interés, en la actualidad no existen muchos estudios del uso de nanopartículas en el área de reproducción animal lo que lo convierte en un campo sumamente explotable, además es importante resaltar que los extractos de plantas representan una buena alternativa a los antioxidantes más comunes utilizados convencionalmente para la conservación del semen ya que su inclusión en los diluyente de semen lo hace rentable debido a su bajo precio y en el particular del chile Yahualica, tiene incluso un impacto sumamente positivo a nivel cultural, social y económico para los agricultores y productores de dicha región 
 

5. Literatura citada
 

Ahmed, S., Ahmad, M., Swami, B. L., & Ikram, S. (2016). A review on plants extract mediated synthesis of silver nanoparticles for antimicrobial applications: a green expertise. Journal of advanced research, 7(1), 17-28.

Basioura, A., Michos, I., Ntemka, A., Karagiannis, I., & Boscos, C. (2020). Effect of iron oxide and silver nanoparticles on boar semen CASA motility and kinetics.

Boomi, Pandi, et al. "Green biosynthesis of gold nanoparticles using Croton sparsiflorus leaves extract and evaluation of UV protection, antibacterial and anticancer applications." Applied Organometallic Chemistry 34.5 (2020): e5574.

Denev, P., Todorova, V., Ognyanov, M., Georgiev, Y., Yanakieva, I., Tringovska, I., ... & Kostova, D. (2019). Phytochemical composition and antioxidant activity of 63 Balkan pepper (Capsicum annuum L.) accessions. Journal of Food Measurement and Characterization, 13(4), 2510-2520.

Lomelí-Rosales, D. A., Zamudio-Ojeda, A., Reyes-Maldonado, O. K., López-Reyes, M. E., Basulto-Padilla, G. C., Lopez-Naranjo, E. J., ... & Velázquez-Juárez, G. (2022). Green synthesis of gold and silver nanoparticles using leaf extract of Capsicum chinense plant. Molecules, 27(5), 1692.

Smitha, S. L., Nissamudeen, K. M., Philip, D., & Gopchandran, K. G. (2008). Studies on surface plasmon resonance and photoluminescence of silver nanoparticles. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 71(1), 186-190.

Vanaraj, S., Keerthana, B. B., & Preethi, K. (2017). Biosynthesis, characterization of silver nanoparticles using quercetin from Clitoria ternatea L to enhance toxicity against bacterial biofilm. Journal of Inorganic and Organometallic Polymers and Materials, 27, 1412-1422.