Resumen

Se compararon dos condiciones de ventilación. En la primera, la concentración de CO₂ fue gradualmente obtenida a través del propio metabolismo del embrión en una incubadora no ventilada (NV) durante los primeros 10 días de desarrollo embrionario (DE10). Posterior al día 10 DE, la incubadora se ventiló normalmente durante el resto del período de incubación. En la segunda condición, la incubadora fue ventilada normalmente (V) durante todo el periodo de DE. La concentración de CO₂ en la incubadora V se mantuvo constante en 0.13% durante los primeros 10 días del DE; por el contrario, en el tratamiento NV, la concentración aumentó gradualmente de 0.14% a 0.9% a los 10 días de DE. Durante todo el período de incubación, la incubación NV exhibió una pérdida de peso de huevo (EWL) y mortalidad embrionaria significativamente (P<0.05) menor en comparación con la incubación V. Sorprendentemente, la incubabilidad de huevos fértiles (HFE) de gallinas reproductoras pesadas jóvenes (37 semanas de edad) fue significativamente mayor 10% bajo condiciones de NV. en comparación con el grupo control V. La incubación NV a gran altitud (2230 m) produjo embriones con masa corporal libre de yema más pesada, con una tendencia progresiva a pesos más ligeros del saco vitelino desde el día 10 DE hasta la eclosión. El peso de los pollitos neonatos en el tratamiento NV fue de 43.4 g, con una longitud de 17.5 cm, ambas características fueron significativamente mayores (P<0,05) que los pollitos recién nacidos del grupo V (41.5 g y 17.2 cm respectivamente). La incubación en condiciones NV a gran altitud mostró un impacto positivo en la calidad de los pollitos recién nacidos en comparación con la calidad de los pollitos eclosionados en condiciones V. La condición NV durante los primeros 10 días de incubación a gran altitud mostró los mejores resultados ambientales y de incubabilidad. Se concluye que la condición NV, con aumento gradual en la concentración de CO² durante los primeros 10 días de incubación a gran altura, es preferible a las condiciones V.

Palabras clave: Gallináceas, Hipercapnia, Hipoxia, Normoxia, Incubabilidad de huevos fértiles, Embrión, Mortalidad embrionaria, Calidad del pollito.
 

1. Introdución

El desarrollo embrionario (DE) en aves domésticas (Gallus gallus) está influenciado por una combinación de factores bióticos y abióticos, dentro de ellos, el legado genético y las condiciones ambientales (Mortola and Awam, 2010). El bagaje genético juega un papel crucial en la configuración del crecimiento y desarrollo en las aves domésticas, como lo muestran las diferentes características observadas en pollos de engorda y gallinas ponedoras ligeras (Cooper et al., 2011; Ho et al., 2011; Bilalissi et al., 2022). La cría selectiva a lo largo de los años ha dado como resultado diferencias significativas entre estos dos tipos de aves, lo que afecta su DE durante la incubación (Bednarczyk et al., 2021; Juárez-Estrada et al., 2024). Los factores ambientales que influyen en los requerimientos del DE para obtener una incubación exitosa incluyen la temperatura, la humedad relativa (HR), movimiento del aire, velocidad del aire y la composición gaseosa específica del ambiente (Molenaar et al., 2010; Boleli et al., 2016).

 

“El ambiente gaseoso es particularmente importante ya que este puede influir en las trayectorias de desarrollo de los sistemas fisiológicos reguladores en las aves domésticas (De Smit et al., 2006; Everaert et al., 2007; Molenaar et al., 2010; Tona et al., 2022)”.

 

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Se ha propuesto que modificar el entorno de un organismo en desarrollo podría cambiar las trayectorias del desarrollo de algunos en sus sistemas fisiológicos de regulación. Este fenómeno se conoce como heterocaricidad (versus heterocronicidad), un tipo específico de plasticidad que describe el momento alterado del desarrollo impulsado por el medio ambiente dentro de una especie (Spicer and Burggren, 2003; Rundler and Spicer, 2016). La plasticidad en el momento del inicio de los eventos del desarrollo ocurre a nivel individual durante su desarrollo, lo cual actualmente sugiere un posible efecto epigenético (Spicer and Burggren, 2003; Blacker et al., 2004; Rundler and Spicer, 2016; Bednarczyk et al., 2021). Para alcanzar un DE normal se necesitan niveles adecuados de oxígeno y una suficiente cantidad de eliminación de dióxido de carbono (Ar y Deeming, 2009). La hipoxia crónica durante las fases críticas del desarrollo del embrión aviar puede tener diversos efectos (Mortola, 2009). La hipoxia crónica durante las fases críticas del DE del pollito puede afectar la tasa de supervivencia, el peso corporal y provocar anomalías del desarrollo (Blacker et al., 2004; Hassanzadeh et al., 2004;  Chan y Burgreen, 2005; Tintu et al., 2009). Es relevante destacar que la hipoxia acelera el proceso de desarrollo de los embriones de pollo, lo que conduce a una eclosión más temprana, atribuida a una maduración más temprana del sistema surfactante respiratorio (Blacker et al., 2004; Chan and Burgreen, 2005; Sharma et al., 2006; Haron et al, 2021). La hipoxia retrasa la aparición de todas las respuestas cardiovasculares durante el desarrollo de ciertas especies de vertebrados y modifica el tiempo de respuesta del programa de desarrollo (Galli et al., 2023). Este evento ilustra lo que algunos investigadores describen como la tercera forma de heterocaricidad: donde el arranque de un sistema regulatorio funcional cambia alterando tanto el inicio de la regulación como la duración del programa de desarrollo diferencial (Spicer y Burggren, 2003; Blacker et al., 2004; Rundle y Spicer, 2016). En la naturaleza, durante el desarrollo temprano del embrión aviar, la hipercapnia crónica con concentraciones de hasta 1% de CO₂, es mucho más frecuente que la hipoxia. El aire atmosférico contiene entre 0.03 y 0.04% de CO₂ y aproximadamente 21% de O₂. Sin embargo, la concentración de CO₂ puede superar el 1% en el nido de las gallinas domésticas durante la incubación natural, mientras que la concentración de CO₂ en el aire ambiental permanece alrededor de  0.03%. Aunque el suministro de O₂ y CO₂ durante la incubación es crucial para el desarrollo de los embriones de pollo y su proceso de eclosión, se ha observado también que el consumo de O₂ y la producción de CO₂ aumentan a medida que el embrión se desarrolla (García et al., 2013; Juárez-Estrada et al., 2024). Las investigaciones indican que el papel del CO₂ en el DE es complejo, y los estudios se han centrado en factores como el intercambio de O2 y niveles presentes de pH en lugar de solo enfocarse a niveles elevados de CO₂ desde el inicio del período de DE. A medida que la altitud aumenta, la presión parcial de O₂ disminuye, afectando el intercambio de gases en el huevo incubado (Visschedijk, 1991). Se ha observado que las concentraciones de O₂ y en consecuencia las de CO₂ influyen en la mortalidad e incubabilidad de los embriones durante la incubación a gran altitud (Hassanzadeh et al., 2004: Ahmed et al., 2013; Okur et al., 2022: Juárez-Estrada et al., 2024). A medida que aumenta la altitud, la presión atmosférica disminuye, lo que afecta la presión parcial (Pa) de gases individuales como O₂ y CO₂ (Visschedijk, 1991).  Sin embargo, la composición porcentual de estos gases en el aire permanece constante. Si bien los parámetros sanguíneos pueden no presentar cambios significativos, el desarrollo morfofisiológico de los órganos respiratorios como corazón y pulmones puede verse influenciado por la concentración de O₂ en la máquina incubadora, especialmente en relación con una gran altitud (Beker et al., 1995; Hassanzadeh et al., 2004; Okur, 2019; Okur et al, 2022). Para compensar la insuficiencia de O₂ regularmente se observa hipertrofia y desarrollo anormal de los órganos respiratorios (Hassanzadeh et al., 2004; Villamor et al., 2004; Mortola, 2009; Okur et al, 2022). Por lo tanto, es necesario compensar el bajo contenido de oxígeno en el aire agregando porcentajes crecientes dentro de la incubadora o bien aumentar la presión atmosférica dentro de las instalaciones a gran altitud (Sahan et al., 2011; Yilmaz-Dikmen et al., 2014), sin embargo, ambas medidas representan riesgos y desafíos tecnológicos complicados. En regiones de gran altitud como algunas partes de la India, América del Sur y México (2200-4000 m), se han reportado tasas muy bajas de incubabilidad (García et al., 2013; Ahmed et al., 2013). Usualmente, los huevos fértiles de gallina se incuban en un ambiente que contiene un 21% de oxígeno y un 0.5% de dióxido de carbono (Cobb, 2022; García et al., 2013).  Sin embargo, diversas investigaciones sugieren que niveles de CO₂ más altos que los que se utilizan regularmente en sistemas de incubación multietápico (0.1-0.5%) pueden ser benéficos para el DE y la incubabilidad, lo cual depende del momento de aplicación de la hipercapnia durante la incubación (De Smit et al., 2006; García et al., 2013; Okur, 2022; Fares et al., 2023; Juárez-Estrada et al., 2024). La presencia de altas concentraciones de CO₂ durante la incubación puede influir en la incubabilidad, el peso del embrión y el desarrollo fisiológico de los embriones de pollo, destacando la importancia de las condiciones de intercambio gaseoso para el óptimo desarrollo del embrión (Fernandes et al.,  2017; Tona et al., 2022; Fares et al., 2023). El dióxido de carbono juega un papel más importante de lo que se creía durante el proceso de incubación de los huevos de la gallina doméstica. Si bien usualmente se pensaba que el CO₂ era perjudicial para el embrión en desarrollo, esta creencia se pudo deber a la suposición de que el embrión necesita aire fresco y mucho oxígeno para lograr un desarrollo embrionario óptimo (Everarert et al., 2007). De hecho, con niveles atmosféricos de CO₂ entre 0.03% y 0.04%, y un promedio de CO₂ de 0.4% medido directamente en el nido bajo la gallina, es evidente que las gallinas incuban sus huevos manteniendo la concentración de CO₂ por arriba del nivel que se encuentra en el ambiente. Se ha observado que niveles más altos de CO₂ durante el proceso de incubación artificial estimulan el DE durante el inicio del período de incubación. (De Smit et al., 2006, 2008; Okur et al., 2022; Fares et al., 2023; Juárez-Estrada et al., 2024). Al modificar las condiciones de ventilación para permitir el aumento gradual natural de CO₂ durante los primeros 10 días de la DE en la incubadora da como resultado un mayor peso corporal absoluto y relativo (con respecto al peso total del huevo) del día 10 al 18 de DE (De Smit et al., 2006; Willemsem et al., 2008; Juárez-Estrada et al., 2024). Esto sugiere que niveles más altos de CO₂ durante la incubación temprana pueden acelerar el crecimiento embrionario y elevar los niveles de corticosterona y T3 en plasma (De Smit et al, 2006; El-Hanoun et al., 2019;  Fares et al., 2023).  El-Hanoun et al. (2019) observaron que los huevos de patos (Pekín) incubados en una incubadora hermética con una concentración creciente de dióxido de carbono del 1% hasta los 10 días de incubación, al final del proceso mostraron mayor peso corporal y mayor HFE, lo que indica que una condición NV durante los primeros 10 días de incubación en patos es preferible a una condición V. En un estudio donde se incubaron huevos de aves reproductoras jóvenes (Ross 308) a gran altitud en una incubadora hermética que permitió que el nivel de CO₂ aumentara al 1.2 % al día 10 de DE seguida de incubación estándar, se observó una mejoria del 7 % de HFE en comparación con el grupo V control (García et al., 2013). En un estudio reciente, Fares et al. (2023) descubrieron que los altos niveles de dióxido de carbono (0.9 %) durante el DE temprano (0-9 días) contribuyeron a una eclosión más estrecha y temprana, a mayor HFE y a mayor peso de los pollitos nacidos comparados con el grupo control V. Si bien los efectos de diferentes niveles de CO₂ sobre la incubabilidad de los huevos han sido ya documentados en la literatura, la suposición en la industria avícola de que los niveles elevados de CO₂ al comienzo de la incubación a gran altitud mejoran la incubabilidad y la calidad de los pollitos aún no se encuentra respaldada con suficientes evidencias científicas (García et al., 2013; Özlü, et al., 2019; Okur et al., 2022). El objetivo de este estudio fue evaluar si el incremento gradual de CO₂ durante los primeros 10 días de incubación a una altitud de 2230 m.s.n.m., seguido de una ventilación estándar hasta la eclosión muestra efectos benéficos sobre la incubabilidad y la supervivencia del embrión. El objetivo fue investigar también si la manipulación de la ventilación tiene algún impacto en la evolución natural de los niveles de CO₂ dentro de la incubadora, el crecimiento de los embriones, su viabilidad, los eventos de eclosión y la calidad de los pollos de engorda de un día de edad.

2.0 Material y métodos

2.1 Huevos fértiles aptos para incubación 

El estudio utilizó huevos fértiles aptos para incubar de una parvada de gallinas reproductoras pesadas Ross 308 de 37 semanas de edad. La granja de aves reproductoras se ubica a 1,350 m.s.n.m., en Jiutepec, Morelos, México. Se recolectaron y almacenaron 420 huevos aptos para incubación, los huevos fueron colocados con el polo agudo hacia abajo en un almacén refrigerado (18°C y 75% HR) durante un periodo de 3 a 7 días antes de iniciar su incubación. Todas las bandejas de huevos fueron trasladadas a una sala de incubación experimental ubicada en la Ciudad de México a 2,230 m.s.n.m. Al arribo, todos los huevos fueron asignados aleatoriamente en dos grupos de igual cantidad, los huevos fueron identificados, pesados y colocados en diez incubadoras comerciales automáticas de aire forzado (Hova-Bator^® Mod. #1583 G.Q.F. Inc. Savannah, Georgia, U.S.A.).

2.2 Diseño Experimental

El primer grupo de huevos aptos para incubar se colocó durante todo el período de incubación en una incubadora ventilada normalmente (V). El segundo grupo de huevos aptos para incubar se incubó durante los primeros 10 días de incubación en una incubadora no ventilada (NV). La condición hermética se logró cerrando con adhesivo de polipropileno (Tuck^® Sarasota, FL, USA) 8 de las 12 aperturas de ventilación (damper) inferiores y las dos salidas (exhaucio) superiores de la incubadora comercial. Del décimo día de desarrollo embrionario (10DE) hasta el 18 DE, ambos tratamientos se mantuvieron bajo las mismas condiciones V. Se incubaron 42 huevos en cada tratamiento, cada tratamiento se repitió cinco veces de manera isotemporal. Los primeros dos días todos los huevos se incubaron a 100.0°F de bulbo seco, de 3 a 7 días a 99.9°F, de 8 a 10 días a 99.7°F, de 11 a 13 días a 99.5°F, de 14 a 15 días a 99.3°F, los días 16 y 17 a 99.0°F, y del día 18 al 21.5 a 98.4°F. En la condición V, desde el día 1 del DE hasta el día 18 de DE, y en las condiciones NV desde el día 10 de DE hasta el día 18 DE, el bulbo húmedo se mantuvo a 84.5ºF. Los huevos se movieron lateralmente cada hora del día 1 al 18 de incubación (posición del eje longitudinal con el polo agudo hacia abajo isoangular de 45° a la contraria 45°). A las 444 h de incubación, los huevos se pesaron y se ovoscopiaron. Todos los huevos con embriones vivos fueron transferidos a bandejas fijas de nacedora. El bulbo húmedo de la nacedora se mantuvo a 90.0ºF del día 18 DE hasta la eclosión. Las incubadoras fueron monitoreadas 6 veces al día para asegurar su correcto funcionamiento. Para realizar un seguimiento preciso del tiempo de eclosión, la hora en que se colocaron los huevos en cada incubadora se registró como la hora cero. Las concentraciones de CO₂ y O₂ dentro de cada máquina se midieron cuatro veces al día (mañana, mediodía, tarde y noche) utilizando un sensor infrarrojo (NDIR) y un sensor de celda galvánica, respectivamente. (Analox^®, Analox Inst. Ltd. The Vale, London W3 7QE, UK). Antes de cada medición, los analizadores de gases se calibraron de forma idéntica utilizando aire atmosférico y gases para calibración de precisión.

2.3 Peso del huevo incubable y masa embrionaria

Los huevos se pesaron individualmente (g) cuando al colocarlos en cada incubadora (0 días), a los 10 y a los 18 días de incubación. En cada condición de ventilación se determinaron durante diferentes intervalos de incubación (0-10, 10-18 y 0-18 días) los porcentajes de pérdida de peso del huevo (EWL). Se tomaron aleatoriamente quince huevos de cada incubadora para determinar EWL utilizando la siguiente ecuación:

Para determinar la relación entre el peso corporal del embrión sin yema y el peso del saco vitelino solo con respecto al peso del huevo, aleatoriamente se tomaron 5 huevos por incubadora a los 10, 12, 14, 16 y 18 días de incubación, y 9 pollitos por bandeja de la máquina nacedora. Los pesos de base húmeda y seca del embrión sin yema, el saco vitelino, el corazón y el hígado de cada huevo y pollito recién nacido muestreados se midieron de acuerdo con la metodología descrita previamente por Willemsen et al (2011). Brevemente, después de una cuidadosa separación del embrión y el saco vitelino, ambos se pesaron. Los embriones se pesaron después de secar el exceso de líquido con papel absorbente (Versi-Dry^® Thermo Scientific). Para el proceso de desecado del embrión, se excluyeron los órganos internos, la piel y las membranas extraembrionarias, mientras que el saco vitelino completo se deseco como una sola pieza. El embrión sin yema, el saco vitelino, el corazón y el hígado se desecaron calentándolos en una estufa seca a 140°F durante 72 horas hasta alcanzar un peso final estable.

2.4 Parámetros de incubación y eclosión

Después de la transferencia a las canastillas de la nacedora al día 18 de DE, los huevos se monitorearon individualmente cada 2 horas, iniciando a las 468 horas durante un periodo de 48 horas. Durante este período, se registró la frecuencia de picaje interno (IP), picaje externo (EP) y la eclosión del pollito de cada huevo. Los pollitos eclosionados por completo con ombligo cicatrizado y con la cabeza y cuello secos se extrajeron de la máquina para su evalaución. Para cada huevo, la duración de la incubación se determinó como el período entre el arranque de la incubación y el momento de su eclosión. 

Al final de la incubación, la incubabilidad de los huevos fértiles (HFE) se determinó de acuerdo a la siguiente ecuación: 

Total de pollitos recién nacidos/total de huevos fértiles x 100

La incubabilidad total de los huevos (HES) se determinó utilizando la siguiente ecuación: 

Total de pollitos recién nacidos/total de huevos incubados x 100

Después de retirar los pollitos recién eclosionados, estos se pesaron con una balanza de precisión de 0.1 g, se midió su longitud y se les otorgó una puntuación de calidad bajo condiciones aleatorias de evaluación doble ciego. La ventana de nacimientos se registró como el tiempo transcurrido entre el primer y último pollito nacidos dentro de cada grupo de tratamiento.

2.5 Mortalidad embrionaria

Los huevos que no eclosionaron después de los 21,5 días de incubación se examinaron macroscópicamente con la finalidad de estimar la tasa de fertilidad y evaluar la etapa de desarrollo alcanzada antes de que muriera el embrión. En la medida de lo posible el tiempo de mortalidad embrionaria se estimó en periodos de días. El porcentaje de mortalidad embrionaria, expresado como porcentaje parcial del total de los huevos diagnosticados como fértiles, se clasificó y registró en diferentes períodos del DE.  La mortalidad embrionaria temprana (EED) ocurrió durante la etapa I (días 1 a 7 del DE), la mortalidad embrionaria media (MED) durante la etapa II (días 8 a 17 del DE), la mortalidad embrionaria tardía (LED) durante la etapa III (días 18 a 21 del DE) y los huevos picados no nacidos antes de las 516 horas (HPN) se clasificaron como etapa IV.

2.6 Escala de calificación de calidad de los pollitos

Todos los pollitos eclosionados fueron retirados e identificados individualmente. Cada pollito fue examinado macroscópicamente para identificar características asociadas con una calidad excelente, muy buena, promedio, deficiente e inclasificable. Esta metodología evaluó la calidad de los pollitos basándose en observaciones de campo de diversas condiciones físicas cruciales para el desarrollo exitoso posterior de los pollitos, incluido el peso y longitud corporal inicial, nivel de actividad, condición de las plumas, integridad ocular, presencia de defectos congénitos o genéticos, fortaleza de las patas, morfología de los dedos, nivel de hidratación, condición del área del ombligo, integridad de la cloaca y restos de saco vitelino. La puntuación de la calidad de los pollitos recién nacidos se basó en trece características. Estas incluyeron principalmente condiciones físicas, como limpieza y humectación corporal, nivel de actividad, apariencia de los ojos, cantidad de saco vitelino retraído, cantidad de saco vitelino remanente, conformación de piernas y patas, integridad del tarsometatarso y dedos de las patas, apariencia del ombligo, presencia de membranas y desechos restantes, apariencia de la cloaca, condición de hidratación, peso corporal y longitud del pollito. En cada pollito se registraron los rasgos cuantitativos, peso corporal (medido en gramos) y longitud total (medido en centímetros). Para medir la longitud total de los pollitos, cada pollito se colocó pico abajo sobre una superficie plana, asegurándose de que el cuello y la pata derecha estuvieran completamente extendidos hasta su longitud máxima sin incomodar o lesionar al ave. La longitud del pollito se definió como la distancia desde la punta del pico hasta el punto donde se une la uña con la falange del tercer dedo. (Tona et al., 2003, 2004; Wolanski et al., 2006; Willemsen et al., 2008). Todos estos métodos se encuentran indicados y descritos en la Tabla 1. 

 

La puntuación de calificación asignada a cada pollito recién nacido se utilizó para crear un índice de calidad de los pollitos neonatos (CHQ).  A cada parámetro se le asigno un valor de calificación en función del desempeño posterior que muestran las aves durante su fase de crianza en granja, esto de acuerdo a como lo han descrito previamente Tona et al. (2005) y Willemsen et al. (2008, 2010). Las características discretas se calificaron en una escala de 0 a 100 puntos, de acuerdo a como se describe en la Tabla 2.

 

La asignación del rango de puntaje de calidad fue la siguiente: 90-100 puntos = Excelente, 80-89 = Muy Buena; 70-79 = Promedio; 60-69 = Deficiente y < 59 = Inclasificable. La puntuación final permitió calificar cada rango porcentual en cada tratamiento de ventilación (V y NV). Todas las mediciones se realizaron de manera doble ciego, cada parámetro se midió para todos los pollitos tomados en orden aleatorio de todo el lote antes de evaluar el siguiente parámetro.

2.7 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados a través de análisis de varianza (ANDEVA) por medio de un modelo lineal general (GLM) (SAS/STAT 9.2. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Las variables paramétricas fueron el peso de los huevos al inicio de la incubación, peso húmedo y seco del embrión sin saco vitelino, peso húmedo y seco del saco vitelino, peso húmedo y seco del corazón e hígado, longitud total y peso corporal de los pollitos recién eclosionados. Antes de realizar el análisis estadístico, los datos de los parámetros de incubación y eclosión, y las pérdidas de peso de los huevos se sometieron a una transformación obteniendo el arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Posteriormente todos estos datos se analizaron mediante un ANDEVA por medio de un GLM. Cuando se detectaron diferencias significativas entre tratamientos, para discriminar diferencias específicas entre los grupos se realizaron comparaciones post-hoc utilizando la prueba de Tukey (P<0,05). Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar (DE). La prueba de Chi-Cuadrada fue utilizada para evaluar las diferencias entre etapas de mortalidad embrionaria (I, II, III y PNH), también se empleó para el análisis de las proporciones de la puntuación de calidad de los pollitos de un día de edad. La determinación de significancia estadística fue basada en un umbral de P <0.05.
 

3.0 Resultados

Ambiente de la Incubación

La Figura 1A muestra una concentración de CO₂ baja (0.13%) pero constante en la condición V durante los primeros 10 días de desarrollo embrionario, mientras que la condición NV mostró un aumento gradual en la concentración de CO₂ desde el inicio de la incubación hasta el día 10 DE, alcanzando una concentración de 0.88% de CO₂ en esta fecha (Figura 1). 
 

Durante los primeros 10 días de DE, la condición V mostró mayor concentración de O₂ (19.85%) significativamente mayor (P<0.05) al 19.55% de O₂ registrado en el tratamiento NV. Desde el día 10 DE hasta la eclosión, la condición NV exhibió mayor concentración de CO₂ los días 13, 14 y 21 de desarrollo embrionario (Figura 1A), mientras que ambas condiciones de ventilación mantuvieron niveles similares de O₂ durante este mismo período (Figura 1B). La sala de incubación mantuvo una temperatura promedio de 24.4°C y una humedad relativa del 53.3% durante todo el período experimental. Los niveles de O₂ medidos fueron de 19.88%, con una concentración de CO₂ de 0.10%.
 

Pérdidas de peso del huevo

El peso promedio de los huevos aptos para incubar al arranque de la incubación fue de 61.4 ± 4.07 g en el grupo V y de 61.9 ± 3.59 g en el grupo NV, sin determinar diferencias significativas entre ambos grupos. En la condición V, la EWL al día 10 de DE fue de 6.26 ± 1.00 %, significativamente mayor (P<0,05) al 5.30 ± 1.56 % registrado en el grupo NV (Tabla 3). Cuando todos los huevos para incubar se transfirieron a las bandejas de la nacedora, el grupo V exhibió un EWL promedio de 11.65 ± 1.93 %, significativamente mayor (P<0,05) al 10.45 ± 2.07 % de EWL observado en el grupo NV (Tabla 3). La pérdida de peso del huevo del día 10 al 18 de DE no mostró diferencia entre los tratamientos (Tabla 3).

 

Parámetros de incubación y eclosión

En el grupo V, el HFE fue de 56.7 %, significativamente menor (P<0,05) al 66.9 % de HFE observado en el grupo NV (Tabla 4). La incubabilidad total de los huevos en la condición V fue de 53.18 % significativamente menor (P<0,05) comparada con el 57.95 % registrado en el grupo NV (Tabla 4). Los embriones del grupo NV comenzaron a eclosionar 11.5 horas antes (P<0,05) que los del grupo V. La ventana de eclosión fue de 49 horas para los pollitos del tratamiento NV y de 41 horas para el tratamiento V, sin que se observaran diferencias significativas entre ambos grupos.
 

Análisis de mortalidad embrionaria

Durante la primera etapa de DE, no se observaron diferencias significativas en la mortalidad embrionaria entre las condiciones NV y V. Los resultados de la Tabla 4 muestran diferencias en la mortalidad embrionaria entre los tratamientos NV y V desde la etapa intermedia en adelante. El tratamiento NV mostró una tasa de mortalidad embrionaria media del 9.3%, significativamente menor (P<0,05%) en comparación al 17.1% observada en el grupo V (Tabla 4). Los embriones que murieron en la etapa tardía (18-21 días de DE) predominantemente se observaron en la condición V (17.3%), que fue significativamente mayor (P<0,05) al 7.43% de mortalidad embrionaria observada en el grupo NV ( Tabla 4). El porcentaje de huevos picados no nacidos en el grupo NV fue 0%, significativamente menor (P<0.05) al 1.2% observado en el grupo V. La mayor mortalidad embrionaria total se observó en el grupo V (53.3%), mientras que el grupo NV mostró 20.2% menos de mortalidad total (Tabla 4).

 

Desarrollo embrionario y pollitos eclosionados

El peso de los pollitos de un día de edad del grupo NV, fue de 43.41 ± 1.84 g, significativamente mayor (P<0.05) a los 41.51 ± 1.58 g registrados en los pollitos del grupo V control. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la longitud de los pollitos eclosionados entre las ambas condiciones de ventilación (Tabla 5). 

 

La masa corporal embrionaria libre de yema del tratamiento NV, ya sea húmeda o desecada, fue consistentemente más pesada en comparación con el grupo V control desde el día 10 hasta el día 18 DE, esta tendencia se mantuvo en los pollitos de engorda nacidos (Figuras 2, 3, 4 y 5). Por otra parte, la masa de saco vitelino húmeda y desecada del grupo control V consistentemente fue más pesada (P<0.05) comparada con la del grupo NV a los días 10, 14, 16 y 18 del DE, tendencia también observada en los pollitos recién eclosionados (Figuras, 2, 3, 4, y 5). 

La masa húmeda del saco vitelino del grupo V no mostró ninguna diferencia al día 12 de DE en comparación con del saco vitelino del grupo NV. La masa desecada del saco vitelino solo mostró diferencia entre los grupos al día 10 del DE (Figura 3). 
 

Los corazones de los embriones en el grupo NV fueron significativamente más pesados (P<0,05) que los del grupo V desde los días 12 a 16 de DE, así como también en los pollitos recién eclosionados (Tabla 6). Al día 18 de desarrollo embrionario, no hubo diferencias en el peso del corazón entre los grupos. Sin embargo, el hígado fue significativamente más pesado (P<0.05) en el grupo NV comparado con los del grupo V desde el día 12 hasta el día 18 de DE, incluyendo también a los pollitos neonatos evaluados (Tabla 6).

Índice de calidad de los pollitos recién nacidos

Utilizando la metodologia planteada ninguno de los pollitos evaluados recibió una puntuación de calidad excelente y, si bien se observó una ligera tendencia hacia una muy buena calidad en los pollitos del grupo NV, finalmente no hubo diferencias significativa entre ambos grupos (Tabla 5). El 47.89 % de los pollitos nacidos en la condición NV de incubación recibieron una puntuación media de calidad, un porcentaje mayor (P<0.05) al 20.83% observado en el grupo control V (Tabla 5). El grupo de control V mostró una cantidad significativamente mayor (P<0.05) de pollitos de calidad deficiente (48.61%) y fuera de clasificación (6.25%) en comparación con los pollitos del grupo NV (20.63% y 2.50% respectivamente).

4.0 Discusión

La disminución de la incubabilidad observada en el grupo V estándar podría atribuirse a las elevadas tasas de mortalidad embrionaria media y tardía, así como a la mayor cantidad de pollitos picados no eclosionados. En contraste al grupo NV, el cual mostró una mortalidad embrionaria significativamente reducida durante las dos últimas etapas de desarrollo embrionario. El grupo NV mostró un mayor peso de los embriones desde el décimo día de desarrollo embrionario hasta la eclosión, lo que indica un DE más robusto que el observado en los embriones del grupo control V. 

De acuerdo a Willemsen et al. (2008), los embriones que sobreviven a una condición NV temprana exhiben mejores condiciones fisiológicas que les permiten acelerar su propio DE, lo cual es consistente con los patrones de heterocaricidad planteados por Spicer y Burggren (2003).

 

“Los embriones en la condición NV que sobrevivieron a la etapa media de desarrollo embrionario podrían haber alcanzado una etapa morfofisiológica más avanzada en comparación con los embriones de la condición V (De Smit et al., 2006). ”.

 

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Si bien los niveles de CO₂ experimentados por los embriones del grupo NV fueron muy elevados al inicio de la etapa embrionaria media, estos no fueron tan perjudiciales como antes se consideraba podrían llegar a serlo (Bruggeman et al., 2007; Everaert et al., 2010). De esta manera se apoya la idea de la tolerancia fisiológica del embrión a un incremento posterior mayor de CO₂ durante las últimas etapas del DE (Bruggeman et al., 2007; Everaert et al., 2010). Diferentes grupos de investigación han indicado que un aumento gradual de CO₂ del 0.8% al 1.5% durante la primera mitad de la incubación de las aves domésticas acelera el DE, mejora la condición morfofisiológica de los embriones y contribuye a una mayor incubabilidad y calidad de los pollitos eclosionados (De Smit et al, 2006, Bruggeman et al, 2007; García et al., 2013;  Fernandes et al., 2014; Okur et al., 2022; Fares et al., 2023; Juárez-Estrada et al., 2024). Bruggeman et al. (2007) al avaluar las condiciones de hipercapnia (NV) en la primera mitad de la incubación, observaron un crecimiento embrionario acelerado, mayor peso del embrión, eclosión más rápida y mejor calidad de los pollitos neonatos. Estos hallazgos son similares a los resultados obtenidos en nuestro grupo NV. Aunque los resultados de Bruggeman et al. (2007) no mostraron una mejora significativa en la incubabilidad ni una disminución en la tasa de mortalidad embrionaria total, algo que si pudimos constatar en nuestro estudio. Las razones de la inconsistencia en la mejora de los parámetros de incubabilidad observados en los estudios con incremento de CO₂ durante la incubación temprana de las aves, aún no se encuentran dilucidadas de manera satisfactoria (De Smit et al, 2008; Bruggeman et al, 2007; García et al., 2013; Okur, 2019; El-Hanoun et al., 2019;  Özlü et al., 2019; Fares et al., 2023). Los efectos positivos de una condición temprana de NV sobre la incubabilidad pueden probablemente atribuirse a factores bióticos como el genotipo y la edad del lote reproductor, y abióticos como la altitud del sitio de incubación, en lugar de atribuirse únicamente a una mayor o menor concentración incrementada de CO₂ (0.8-1.5%) durante la primera mitad del período de incubación, lo cual complica el análisis certero de este efecto en los diversos estudios realizados (De Smit et al, 2006; 2008; García et al., 2013; Fernandes et al., 2017; El-Hanoun et al., 2019; Okur et al., 2022; Bilalissi et al., 2022; Fares et al., 2023; Juárez-Estrada, et al., 2024). La concentración de 0.88% de CO₂ alcanzada en nuestro grupo NV durante la primera mitad de la incubación a gran altitud, comparada con la registrada en el grupo V de control durante el mismo periodo, resultó en un aumento de diversos beneficios, incluido un DE más acelerado, mayor incubabilidad y mayor peso corporal y calidad general de los pollitos de engorda neonatos. Lo reportado aquí es consistente con las observaciones hechas por De Smit et al. (2006), quienes aplicaron una incubación NV en embriones de reproductoras de pollo de engorde de 60 semanas de edad, logrando una concentración de CO₂ (1.0%) similar a la de nuestro grupo NV. De Smit et al (2006) documento una mayor incubabilidad y mayor peso de los embriones del día 10 al 17 de DE, en comparación con su grupo V convencional. En la condición de NV, la masa corporal del embrión libre de yema superó consistentemente a la masa corporal de los embriones del grupo V durante todo el período de incubación. De manera similar, el peso de la masa embrionaria desecado libre de yema mostró un patrón similar durante casi todo el período experimental. La incubación con el protocolo de NV resultó en mayor crecimiento embrionario y una mayor utilización de las reservas de energía primaria, particularmente del saco vitelino. A partir del décimo día de DE a medida que aumentó el peso del embrión, hubo una correspondiente disminución en el volumen y peso del saco vitelino. La masa embrionaria libre de yema sirve como un mejor indicador del desarrollo del pollo de engorda después de la eclosión en comparación al peso corporal total del embrión debido a que este último incluye el peso de la yema residual aún no metabolizada (Uni and Ferket, 2005; Wolanski et al., 2006). De acuerdo a Wolanski et al. (2006), existe correlación entre el peso húmedo y el peso seco del saco vitelino en comparación con el embrión, un patrón que coincide exactamente con nuestros hallazgos en el grupo NV. El desarrollo embrionario acelerado observada en el grupo NV indica la capacidad de estos embriones para crecer más rápido en condiciones de hipercapnia e hipoxia relativa durante la primera mitad del DE. Estas condiciones ambientales aplicadas en el grupo NV pueden contribuir a optimizar el crecimiento y la funcionalidad de la membrana corioalantoidea (CAM) (Chan y Burggren, 2005; Bruggeman et al, 2007; Fernandes et al., 2017). La estimulación temprana para mejorar el desarrollo y la funcionalidad de la CAM podría conducir a una mejor absorción de O₂ durante la fase exponencial del DE inmediatamente después del día 10 de incubación (fase normotérmica y exotérmica del DE). Esto podría explicar los efectos benéficos que la hipercapnia e hipoxia relativa temprana muestran en las últimas etapas del DE observadas en nuestro grupo NV, potencialmente mejorando la tasa de suministro de energía desde el saco vitelino a través de procesos bioquímicos como la β-oxidación de ácidos grasos y gluconeogénesis (Uni and Ferket, 2004; Uni et al., 2005; Chan y Burggren, 2005; Everaert et al., 2011; Sahan et al., 2014; Fernandes et al., 2017). Durante la incubación natural, a medida que avanza el DE, se observa un aumento en la concentración de CO₂ de 0.04 % a 0.5 %, acompañado de una disminución en los niveles de O₂ de 20,9% a  20.3 % (Walsberg, 1980). De manera similar, en el presente estudio se observó un patrón de disminución de O2 durante los primeros 10 días del DE. En el grupo NV, el  O₂ disminuyó del 19.8% al 19.5%, mientras que el grupo V no experimentó ninguna disminución. Rahn et al. (1977) observaron que, durante la incubación en el nido, los niveles de gas no son fijos y normalmente varían a medida que avanza el DE. Las gallinas en este caso juegan un papel crítico en la regulación de la temperatura ambiental del nido monitoreando frecuentemente la temperatura de los huevos. Una vez que los embriones alcanzan una etapa en la que pueden generar su propio calor metabólico de forma autónoma, las gallinas reproductoras tienden a abandonar el nido con mayor frecuencia para beber y alimentarse, especialmente después de la fase endotérmica de los embriones (1-10 días de incubación) (Scanes y Dridis, 2021). Al abandonar el nido con mayor frecuencia, las gallinas reproductoras facilitan una mayor ventilación, lo que mejora la eliminación de CO₂ y aumenta el suministro de O₂ alrededor de los huevos en el nido. Este proceso progresivamente continúa hasta la eclosión (Rahn et al., 1977; Walsberg, 1980; Scanes y Dridis, 2021). Los embriones del grupo NV consistentemente mostraron mayor peso que los del grupo V. Willemsen et al. (2008) observaron que el peso de los pollitos al nacer exhibe significativamente el mayor valor de predicción para el desempeño post-nacimiento, incluso más que la medición de la longitud total del pollito cuando se consideraba ésta como la única medida predictiva. En el presente estudio, el grupo NV registró los mayores pesos para los pollitos de un día de edad. Sin embargo, no hubo diferencias en la longitud de los pollitos de un día de edad entre ambos grupos. Los estudios realizados por Wolanski et al. (2006, 2007) indicaron que la longitud del pollito tenía una correlación con la masa corporal libre de yema al nacer (r = 0.56). Sin embargo, algunos otros autores han expresado dudas con respecto a la utilidad de la longitud total del pollito como un indicador significativo de calidad (Deeming, 2005; Willemsem et al., 2008). El protocolo de NV temprana permitió obtener embriones sin yema más pesados junto con un peso del saco vitelino progresivamente más ligero, un fenómeno previamente ya informado por varios grupos de investigación (Christensen et al., 2005; De Smit et al., 2006; Wolanski et al., 2006; Bruggeman et al., 2007; García et al., 2013; Juárez Estrada et al., 2024). Esto puede atribuirse a una mayor actividad metabólica temprana del embrión, particularmente en la formación de tejidos, y a la completa satisfacción de los requerimientos energéticos requeridos para su propio desarrollo (Uni and Ferket, 2004; Uni et al., 2005; Lourens et al., 2005; Sato et al., 2006; van der Wagt et al., 2020). El peso y volumen del saco vitelino residual sirven como medidas tanto de la energía fija invertida en el huevo (tamaño de yema) como de la energía utilizada por el embrión durante su propio desarrollo (Uni et al., 2005; Sato et al., 2006; Sahan et al., 2014; van der Wagt et al., 2020). De acuerdo a Moran (2007), a partir del día 12 del DE, el aumento de masa corporal libre de yema presenta una correlación negativa con el peso del saco vitelino. Los embriones del grupo NV exhibieron una proporción relativamente pequeña de saco vitelino comparada con la masa embrionaria sin yema, lo que sugiere que los pollitos de este grupo podrían haber madurado antes que los del grupo V. Adicional a exhibir una tendencia creciente de la masa embrionaria sin yema, los embriones NV supervivientes mostraron mayor peso del corazón y el hígado en comparación con los del grupo V. El aumento observado en el hígado y el músculo coroporal en embriones NV a los 18 días de DE sugiere un mayor almacenamiento de glucógeno, lo que indica un DE más robusto, como sugirió previamente Druyan (2010). El almacenamiento de glucógeno en el hígado y músculos es vital para alimentar los procesos de “picaje” y para eclosión, además de servir como la principal fuente de energía hasta que el pollito recién nacido pueda acceder a alimentos externos (Christensen et al., 2001; Uni y Ferket, 2004; Uni et al., 2005). La incubación temprana con NV no solo genera perfiles óptimos de CO₂ y O₂ sino que también promueve una temperatura constante a nivel del cascarón del huevo (EST). Este efecto combinado contribuye a lograr un DE óptimo y un rápido crecimiento del pollito después de la eclosión (Lourens et al., 2005; Willemsem et al., 2011; Ipek et al., 2014).  El crecimiento posterior a la eclosión y la función de los órganos pueden verse afectados si la tasa de crecimiento durante el DE se desvía de la EST óptima (Lourens et al., 2005; Molenaar et al., 2010; Maatejens et al., 2014; Sgavioli et al., 2016; Sözkü et al., 2022). La incubación NV ayuda a mitigar las oscilaciones de temperatura producidas por el intercambio forzado de aire fresco desde el exterior, lo que se observa comúnmente en la incubación V estándar (García et al., 2013; Ahmed et al., 2013;  Boleli et al., 2016; Sözkü et al., 2022). La incubación NV garantiza un ambiente térmico equilibrado durante la primera mitad de la incubación (García et al., 2013; Maatejens et al., 2014). Este método de ventilación se aplica específicamente durante la fase de crecimiento más crítica del DE (1 a 10 días del DE), donde es crucial mantener un EST constante y cálida (Lourens et al., 2005; Molenaar et al., 2010; Maatejens et al., 2014; Boleli et al., 2016; Scanes and Dridis, 2021; Sözkü et al., 2022). De hecho, el aire húmedo transfiere el calor de manera más eficiente que el aire seco (Boleli et al., 2016). Por lo tanto, restringir la ventilación durante los primeros 10 días del DE crea un ambiente uniforme y cálido. Esto es particularmente crítico, especialmente en altitudes elevadas donde el aire es seco y frío (Ahmed et al., 2013; García et al 2013; Boleli et al., 2016; Okur et al., 2022; Juárez-Estrada et al., 2024). Una sola exposición a un entorno específico durante el crecimiento embrionario temprano puede tener consecuencias a largo plazo en la vida de las aves (Spicer y Burggren, 2003; De Smit et al., 2008; Boleli et al., 2016; Sözkü et al., 2022). En el presente estudio, la condición NV contribuyó a optimizar las etapas posteriores de desarrollo de embriones que estuvieron expuestos tempranamente a hipercapnia e hipoxia relativa. Algunos grupos de investigación han sugerido que la elevada concentración de CO₂ durante las primeras etapas del DE puede ejercer una influencia específica sobre el pH de la albúmina (Bruggeman et al, 2007; Reijrink et al., 2008; Everaert et al., 2011; Burggren et al., 2012; Özlü et al., 2019). La afectación del pH de la albúmina se atribuye a una regulación positiva temprana en la expresión de enzimas dependientes del pH, como la anhidrasa carbónica, que juega un papel importante en las primeras etapas del DE (Everaert et al., 2011). La hipercapnia temprana juega un papel importante en la aceleración de la rotura de las membranas chalazíferas, lo que lleva a una rápida pérdida de dureza tanto en la fase densa como acuosa de la albúmina (Sadler et al, 1954). Adicionalmente, se ha observado que la hipercapnia temprana promueve la formación de líquido subembrionario (SEF) durante las etapas iniciales del DE (Latter y Baggot, 2002). Este fenómeno podría potencialmente contribuir a mejorar el DE temprano y, mejorar posteriormente los resultados de incubabilidad. Algunos de los factores importantes que influyen en el pH de la albúmina, la degradación de las membranas chalazíferas y la óptima formación de SEF son el genotipo, la edad del lote de aves reproductoras y la duración del almacenamiento de los huevos. Las interacciones entre estas variables factiblemente explican la variabilidad de los efectos de la hipercapnia temprana reportada en diferentes estudios, lo que pudo haber conducido en algunos casos a resultados controversiales (De Smith et al., 2006; Juárez-Estrada et al., 2024). Se espera que futuros estudios revelen con mayor precisión los mecanismos exactos por los cuales el CO₂ modifica el DE temprano. Mientras tanto, es esencial el desarrollo de nuevos programas de incubación que consideren concentraciones óptimas de O₂ y CO₂ durante etapas específicas del DE en aves de diferente genotipo y edad.

5.0 Conclusión

El ambiente gaseoso, particularmente la concentración elevada de dióxido de carbono durante períodos críticos de la incubación a gran altitud, mejora significativamente el desarrollo embrionario, la calidad y el peso corporal de los pollitos de engorda de un día de edad. La incubación de huevos fértiles con niveles elevados de CO₂ durante los primeros 10 días de desarrollo embrionario en grandes altitudes resultó en una incubabilidad 10 % mayor en comparación con el grupo ventilado de manera estándar.

6.0 Referencias