Resumen

El principal agente antimicrobiano empleado durante el sacrificio de pollo en la industria avícola es el hipoclorito de sodio (NaClO) sin embargo se ha reportado que genera trihalometanos (THMs). El agua electrolizada neutra (AEN) es un sistema de agentes antimicrobianos que presentan un efecto combinado contra microorganismos. El objetivo de este trabajo es estudiar la actividad antimicrobiana del AEN y la formación de THMs generados en carne de pollo por su uso así como su impacto en la vida de anaquel. El AEN presenta una mayor actividad antimicrobiana que el NaClO ante un cultivo mixto de S. Typhimurium ATCC 14028 Nal⁺ y S. Infantis Nal⁺. Mediante microscopía electrónica de barrido y de fluorescencia, se logró visualizar el daño en estructura celular como mecanismo de acción del AEN. No se observó diferencia significativa en la actividad antimicrobiana de AEN y NaClO ante Salmonella en canales de pollo. El AEN resultó más eficiente contra bacterias mesófilas aerobias y coliformes totales en comparación que el NaClO, mostrando diferencia significativa. Además, la carne tratada con AEN mostró un menor cambio en la coloración que la carne tratada con NaClO. Finalmente, mediante el método oficial 8260C de la EPA (Agencia de protección a ambiente en EUA), no se encontraron THMs en carne de pollo tratada con 50 ppm de AEN y NaClO. No obstante, sí se detectaron y cuantificaron al emplear ?100 ppm de NaClO y AEN.

Palabras Clave: Canales de pollo, intervención antimicrobiana, trihalometanos, agua electrolizada neutra

Introducción

La Unión Nacional de Avicultores reporta que los principales Estados productores de pollo son: Veracruz 12%, Aguascalientes 11%, Querétaro 10%, Coahuila y zona La Laguna 9%, Jalisco, Chiapas y Puebla 7%, Yucatán 6%, Guanajuato 5%, Estado de México y Sinaloa 4%, y entre los restantes aportan el 18% (UNA, 2017). Durante el procesamiento de carne de pollo, la legislación mexicana no permite la adición de ningún tipo de agente antimicrobiano, no obstante en algunos países como Estados Unidos, se realizan intervenciones antimicrobianas para optimizar la calidad microbiológica de la carne y con ello extender su vida de anaquel (FSIS, 2012; NOM-194). En la Unión Europea, únicamente se permite el ácido láctico a una concentración máxima de 2% (EFSA, 2014). Salmonella spp., es el principal microorganismo patógeno causante de brotes por consumo de carne de pollo en EUA mientras que en México no se cuenta con estadísticas clínicas sobre las infecciones gastrointestinales por consumo de carne de pollo, sin embargo, se sabe que es un microrganismo patógeno con una alta incidencia en este alimento (Morales et al., 2016). El agente antimicrobiano más común es hipoclorito de sodio (NaClO), debido a su gran capacidad bactericida y bajo costo. Sin embargo, se ha reportado la formación de compuestos tóxicos como los trihalometanos (THMs) generados por su uso (EPA, 2003). El agua electrolizada neutra (AEN) es un agente antimicrobiano que ha sido admitido recientemente (FSIS, 2012) por el Departamento de Agricultura en EUA para el procesamiento de carne de pollo. Dentro de sus ventajas están una alta actividad antimicrobiana en productos en fresco, bajo costo de producción y menor corrosión al equipo industrial, entre otras. Se ha reportado en su composición química la presencia de ácido hipocloroso, ion hipoclorito, dióxido de cloro y ozono. Sin embargo, aún no se cuenta con evidencia científica sobre su efectividad en carne de pollo así como tampoco sobre la posible formación de compuestos tóxicos que pudieran generarse durante su aplicación y que puedan comprometer la inocuidad del alimento.

Objetivo

Estudiar la actividad antimicrobiana de AEN y NaClO así como la formación de THMs generados en carne de pollo durante la intervención antimicrobiana, y su impacto en la vida de anaquel.

Metodología

Determinación de concentración mínima bactericida: Se procedió mediante la técnica reportada por Yang et al. (2013). Empleando AEN y NaClO a  diferentes concentraciones y un control con agua desionizada. Se inoculó cada tubo con un inóculo inicial ajustado de 8 log UFC/mL de una mezcla de las cepas S. Typhimurium ATCC 14028 Nal⁺ y S. Infantis Nal⁺. Se evaluó el efecto de las concentraciones de 5, 7, 9, 11, 13 y 15 ppm para AEN y 25, 50, 70, 90, 110 y 130 ppm para NaClO a los 1, 2, 3, 4 y 5 min de tiempo de exposición. De cada tratamiento se detuvo la actividad antimicrobiana  con solución de buffer neutralizante durante 10 s, y posteriormente se realizaron diluciones seriales para un recuento en placas con agar soya tripticaseína (AST) adicionado de ácido nalidíxico (Nal⁺). El experimento se realizó por triplicado.

Determinación de daño celular mediante microscopia de fluorescencia (MF): se procedió según Ercolini et al., (2005). Se tomó 1 mL del mismo cultivo mixto y se sometió a 9 mL de cada tratamiento (7 y 15 ppm de AEN, 50 y 130 ppm de NaClO) durante 1 min. Posteriormente, se tomó 1 mL de cada tratamiento y se filtró mediante una unidad Swinex  en una membrana negra y se lavaron con solución salina 0.85 % y se dejaron secar las membranas por 3 min en la campana de flujo laminar. Se tiñeron las membranas con una mezcla de colorantes 1:1 (SYTO 9 + yoduro de propidio, kit LIVE/DEATH BACLIGHT ^?) disueltos en agua. Se dejaron reposar las membranas a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 min y se colocaron en un portaobjetos para su observación en microscopio a 500 nm de longitud de onda.

Determinación de daño celular mediante microscopia electrónica de barrido (SEM): Se procedió según Sheen et al., (2015). De los mismos tratamientos que en MF, se tomó 1 mL de cada tratamiento y se filtró mediante una membrana (diámetro de poro 0.45 µm). Se secó cada membrana por 3 min en la campana de flujo laminar y se colocó en una caja Petri pequeña con formaldehído (3%) y dejando reposar durante 12 h. Posteriormente, cada membrana se lavó primero con solución buffer de fosfatos (pH 7.2) y posteriormente con etanol (15%) durante 5 min. Se repitió el procedimiento aumentando la concentración de etanol a 20, 40, 60, 85, 96 y 100% y previo a la observación en microscopio, cada membrana se recubrió con oro/paladio. Las condiciones empleadas en el microscopio fueron: a) Aumento: Rango de 10000 a 50000x, b) Voltaje de aceleración 15 kV, c) Alto vacío: 1.4 x 10^-4 mBa.

Determinación de actividad antimicrobiana de AEN ante Salmonella en canales de pollo: Se procedió según Rahnman et al., (2012). Se emplearon 30 canales de pollo en cada experimento (3 experimentos independientes). Con un inóculo inicial de 6.1 log UFC/mL, se inoculó cada canal en la cavidad gastrointestinal resbalándolo por las paredes de la cavidad y permitiendo un tiempo de adhesión de 10 min en condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Posteriormente, se sometieron las canales los tratamientos de AEN y NaClO (ambos a 50 ppm, por inmersión en 50 L cada tratamiento durante 50 min a 3±2 °C). Posteriormente, se lavó cada canal en 100 mL de buffer neutralizante y se realizaron diluciones seriales en solución salina (0.85%) y se inocularon cajas con agar AST + Nal⁺ por extensión en superficie y determinó a población microbiana.

Efecto de AEN sobre microbiota natural y parámetros fisicoquímicos de carne de pollo: En cada experimento se emplearon 80 canales de pollo, y se realizaron tres réplicas experimentales. Los tratamientos fueron por inmersión en 100 L, durante 85±5  min  a una temperatura de 3±2 °C, con AEN y NaClO (ambas a 50 ppm) y un grupo control con agua. Concluidos los tratamientos, las canales se sacaron, empacaron en bolsas de plástico individualmente, y almacenaron en refrigeración. Posteriormente, se tomaron 5 canales de cada tratamiento y de cada una se cortaron 5 g de grasa, 5 g de piel y 15 g de carne en condiciones asépticas para su posterior análisis fisicoquímico almacenando estas muestras en refrigeración. Posteriormente, las canales se lavaron en solución peptonada (0.1%) para la recuperación de la población de bacterias mesófilas aerobias (según la NOM-092-SSA1-1994) y coliformes totales (según la NOM-113-SSA1-1994. Finalmente, se midió el color mediante un colorímetro Minolta CR400 (parámetros L*, a*  b*) de las canales  en pechuga frontal, pechuga lateral y rabadilla. Este muestreo correspondió al día 0 repitiéndose los días 4, 8 y 10.

Determinación de THMs en carne de pollo: Se procedió según el método 8260c  (EPA, 2006). La columna empleada fue HP-5MS. Se preparó una solución patrón de estándares a una concentración de 20 ppm y se hizo una curva de calibración. Condiciones empleadas: Inyector: 280°C, línea de transferencia: 40 °C iniciales, (rampa 1) 5°C/min hasta 50°C, (rampa 2)10°C/min hasta 250°C, gas acarreador: Helio 99% ultra puro. Experimento 1: se empleó un diseño bifactorial completo 2x3, donde un factor fue el agente antimicrobiano con dos niveles (AEN y NaClO), y el otro factor fue la concentración con tres niveles (50, 100 y 150 ppm). Los tratamientos fueron por inmersión en 2 L con un tiempo de exposición de 50 min y de 2±2 °C. Dos piernas de pollo representaron una unidad experimental. Se empleó un control sin tratamiento para ver que los THMs no estuvieran presentes antes del experimento. De cada pierna de pollo se cortaron 5 g (piel, grasa y carne) y se lavaron con metanol durante 3 min. Posteriormente, se filtraron los tejidos en una membrana (poro de 0.22 µm) y se recuperó el metanol en viales cromatográficos para ser inyectados al equipo. Se realizaron tres réplicas experimentales. Experimento 2: se trataron canales completas (por inmersión en 100 L durante 90 min y de 2±2 °C) con un diseño unifactorial (dos niveles, AEN y NaClO) ambos a 50 ppm. De cada canal se cortaron 5 g de piel, 5 g de grasa y 5 g de carne con el fin de observar si algún tejido en específico fomentaba la formación de THMs. Después de los tratamientos, cada muestra (5 g de cada tejido) se lavó y filtro igual que en el experimento con piernas de pollo.

Resultados

Se puede observar en la Figura (1), que el AEN inactiva una población de 8 log UFC/mL de Salmonella, con una concentración aproximadamente 10 veces menor que el NaClO a un mismo tiempo de exposición.
 

Mediante SEM, se logró observar el efecto antimicrobiano de AEN (7 ppm) al visualizar daño en estructura celular, sin embargo, con un tratamiento sub letal (50 ppm) de NaClO no se observó daño. Adicionalmente, un tratamiento letal (13 ppm) de AEN muestra un alto grado de lisis celular (Figura 2). Lo anterior, confirma lo reportado por Liao et al., (2008), quienes propusieron daño a nivel de membrana causado por un elevado potencial electroquímico (superior a 400 mV) de especies oxidantes.
 

En concordancia, con MF también se logró visualizar daño en la membrana celular, ya que con el tratamiento sub letal (7 ppm) de AEN se observan células sin daño en membrana (teñidas de verde) así como células dañadas (teñidas de rojo). Sin embargo, mediante un tratamiento letal (13 ppm), todas las células que se logran observar muestran daño en membrana. Además, se observa material genético intracelular teñido de rojo liberado durante la lisis celular (Figura 3).
 

Al inocular canales de pollo con el cultivo mixto de Salmonella, no se observó diferencia significativa en la actividad antimicrobiana de AEN y NaClO, alcanzando ambos una reducción de 1.06 log UFC/mL.

Por otro lado, se observó que el NaClO mostró un comportamiento similar al grupo control, mientras que el AEN presentó diferencia significativa con NaClO, resultando más eficiente contra estos grupos bacterianos (Figura 4).

Datos no presentados, revelaron que el AEN no modifica otros parámetros fisicoquímicos de la carne (pH y nitrógeno volátil total) teniendo un comportamiento similar al grupo control. Sin embargo, AEN si presentó diferencia significativa con el NaClO el cual modificó en mayor grado  los parámetros fisicoquímicos de la carne. Adicionalmente, se observó que las canales tratadas con AEN mostraron el menor cambio de color, mientras que las canales tratadas con NaClO mostraron el mayor cambio de color mostrando diferencia significativa con AEN (Figura 5).
 

En el experimento 1, al tratar piernas de pollo con 50 ppm de AEN y NaClO, no se detectaron THMs, sin embargo, al aumentar la concentración a 100 y 150 ppm en ambos agentes, se detectó y cuantificó cloroformo (CHCl₃) estando en mayor cantidad en el tratamiento con NaClO, además que se cuantificaron otros dos THMs.

Finalmente, al tratar canales de pollo con AEN y NaClO (ambas a 50 ppm)  en un experimento de mayor escala, no se detectaron THMs con ninguno de los dos agentes, lo que indica que ninguno de los tejidos analizados (músculo, grasa y piel) promueve la formación de estos compuestos tóxicos.

Conclusión

El AEN presenta una mayor actividad antimicrobiana (~10 veces) ante células planctónicas de Salmonella  en comparación que el NaClO. Además se logró visualizar el daño en superficie celular causado por AEN. Adicionalmente, no existió diferencia significativa en la actividad antimicrobiana de ambos agentes ante Salmonella en canales de pollo. Respecto a la microbiota de la carne de pollo (BMAs y coliformes totales) el AEN resultó más eficiente en la reducción de estos grupos bacterianos mostrando diferencia significativa contra el NaClO y el grupo control. El mayor cambio de color lo presentó NaClO mientras que AEN y el control mostraron resultados semejantes. No se detectaron trihalometanos en carne de pollo al emplear 50 ppm de AEN o NaClO durante la intervención antimicrobiana. Sin embargo, se logró detectar CHCl₃ (193 y 182 ppb) presente en piernas de pollo que fueron tratadas desde 100 ppm de NaClO y AEN, sin encontrar diferencia significativa entre ambos agentes antimicrobianos. Además, se logró detectar CHBrCl₂ y CHBr₃ en tratamientos de 100 y 150 ppm únicamente con NaClO.

Bibliografía

Enviromental Protection Agency (EPA). 2006. Volatile Organic compounds by gas chromatography / mass spectrometry 8260c

Ercolini D., La Storia A., Villani F., Mauriello G. 2005. Effect of a bacteriocin-activated polythene film on Listeria monocytogenes as evaluated by viable staining and epifluorescence microscopy. J. of Appl. Microbiol. 100:765-772.

European Food Safety Authority. 2014. Scientific opinion: Safety and efficacy of peroxyacetic acid solutions for reduction of pathogens in poultry carcasses and meat. BIOHAZ Panel. Parma, Italy. EFSA Journal. 12:3599.

Food Safety and Inspection Service (FSIS) Directive. USDA/FSIS, Washington, DC: Last Review December 21th 2012. Safe and Suitable ingredients used in the production of meat, poultry and egg products. Page. 19.

Liao L. B., Chen W. M., Xiao X. M. 2007. The generation and inactivation mechanisms of oxidation-reduction potential of electrolyzed oxidizing water. J. of Food Eng. 78: 1326-1332.

Morales M. C., Valencia O., Maravilla C. A., Flores I. 2016. Serotipos de Salmonella más frecuentes encontrados en diferentes muestras de aves. 41° Convención Nacional de la ANECA 2016.

Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la cuenta de microrganismos coliformes totales en placa.

Norma Oficial Mexicana NOM-194-SSA1-2004. Productos y servicios. Especificaciones sanitarias en los establecimientos dedicados al sacrificio y faenado para animales para abasto, almacenamiento, transporte y expendio. Especificaciones sanitarias de productos.

Rahman S. M. E., Jiyong P., Kyung B.-S., Al-Harbi N. A., Deog-Hwan O. 2012. Effects of slightly acidic low concentration electrolyzed water on microbiological, physicochemical, and sensory quality of fresh chicken breast meat. J. of Food Sci. 71: 35?41.

Sheen S., Cassidy J., Scullen B., Uknalis J., Sommers C. 2015. Inactivation of Salmonella spp. in ground chicken using high pressure processing. Food Control. 57:41-47.

Unión Nacional de Avicultores (UNA).  Última revisión 5 de junio de 2017.  http://una.org.mx/2013/16-una-general/indicadores-economicos/47-indicadores-economicos

Yang H., Feirtag J., Diez-González F. 2013. Sanitizing effectiveness of commercial ?active water? technologies on Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica and Listeria monocytogenes. Food control 33: 232-238.