Alejandro Castañeda Correa^ab, Julian Trachsel^c, Heather K. Allen^c, Agustín Corral Luna^b, Michael E. Hume^a, Todd R. Callaway^a, Robin C. Anderson^a*, y David J. Nisbet^a

^aUSDA/ARS, Food & Feed Safety Research Unit, 2118 F&B Road, College Station, Texas 77845, USA

^bFacultad de Zootecnia y Ecología. Universidad Autónoma de Chihuahua, Chihuahua, Chih. México, Periférico Francisco R. Almada km 1, Chihuahua, CHIH, 31453, MX.

^cUSDA/ARS Food Safety and Enteric Pathogens Research Unit, 1920 Dayton Ave, Ames, Iowa, USA

RESUMEN

La metanogénesis ruminal es considerada un proceso digestivo ineficiente, ya que durante esta se libera energía dietética en forma de metano (CH₄) y que a la vez contribuye al incremento en la emisión de gases con efecto invernadero (GEI). El nitrato (NO₃) y el 3-nitro-1-propionato (ANP) son nitrocompuestos capaces de inhibir la metanogénesis ruminal. Con el objetivo de evaluar concentraciones sub-toxicas de NO₃ y ANP en forma individual y combinada sobre la producción de CH₄ y las características de fermentación, se desarrolló un experimento utilizando 4 µmol de ANP, 8 µmol de NO₃, 16 µmol de NO₃ y la combinación de 4 µmol de ANP con 8 µmol y 16 µmol de NO₃ bajo un diseño completamente al azar. La producción de CH₄ disminuyó (P < 0.05) en todos los tratamientos en > 96% con relación al control. No se observó efecto (P > 0.05) de la adición de nitrocompuestos sobre la concentración de hidrógeno, sin embargo fue < 50% en relación al control. Se observó un consumo casi total (> 95%) del ANP en los tratamientos en los que se administró individualmente. El ANP y el NO₃ se catabolizaron en < 17% y > 95% respectivamente cuando se administraron en forma combinada. Sin embargo, la concentración de nitrito (NO₂) en los tratamientos a los que se administró NO₃ osciló entre 3 y 12 µmol/mL, lo que representa entre 38% y 69% del NO₃ añadido, respectivamente. La concentración de ácidos totales disminuyó (P < 0.05) en > 32% en los tratamientos individuales y > 46% en los tratamientos combinados en relación al control. La proporción acetato:propionato se incrementó (P < 0.05) hasta 3 veces en todos los tratamientos en relación al control. El balance de hidrógeno indica que la adición de ANP y NO₃ disminuye la producción de agentes reductores en todos los tratamientos, aunque su efecto es mayor cuando se añaden en combinación. La adición de ANP y NO₃ disminuye efectivamente la producción de CH₄, aunque disminuye la fermentación ruminal. Estos resultados servirán de base para futuras investigaciones sobre los efectos inhibitorios de ANP y NO₃ sobre la metanogénesis ruminal.
 

PALABRAS CLAVE: Metano, metanogénesis, nitrato, 3-nitro-1-propionato, nitrito y fermentación ruminal.
 

INTRODUCCIÓN

La metanogénesis ruminal es considerada una pérdida de energía dietética que oscila entre 4% en animales alimentados a base de concentrado y hasta 12% en animales alimentados con forraje (Johnson y Johnson, 1995). La emisión de CH₄ a partir de los rumiantes contribuye hasta 20% de las emisiones totales en los Estados Unidos, además de que posee un potente efecto invernadero (EPA, 2006). Actualmente, se está investigando el uso de nitrocompuestos como aditivos en la alimentación animal para reducir la emisión de CH₄ en los rumiantes. Por consiguiente, se propone como una posible solución el uso de nitrato (NO₃) debido a que es una molécula energéticamente favorable, es decir que es capaz de captar electrones utilizados en la metanogénesis ruminal y de esta manera disminuir la emisión de CH₄ hacia la atmósfera. Sin embargo, existe la preocupación de que el nitrito (NO₂, un intermediario metabólico del NO₃) se acumule dentro del rumen e inhiba la actividad microbiana y que su absorción al organismo cause una intoxicación por metahemoglobinemia (Marais et al., 1988). Por otro lado, se ha observado que algunos nitrocompuestos de cadena corta tales como el nitroetano, 2-nitroetanol, 2-nitro-1-propanol y el 3-nitro-1-propionato reducen la producción de CH₄ in vitro (Anderson y Rasmussen, 1998; Anderson et al, 2003; Bo?ic et al., 2009; Gutiérrez et al., 2008) e in vivo (Anderson et al., 2006; Gutiérrez et al., 2007). Sin embargo, desde un punto de vista práctico, estos nitrocompuestos no son moléculas atractivas para su uso como aditivos en la alimentación animal debido a que son compuestos sintéticos y por lo tanto, se tendrían que desarrollar más experimentos para asegurar su inocuidad en el rumiante. Además, sus subproductos tales como el aminoetano, etanolamina y el aminopropanol son de bajo valor nutricional para el rumiante. Por esto, también se propone como aditivo el uso de 3-nitro-1-propionato (ANP) que es un metabolito secundario de las plantas y hongos que se metaboliza a ?-alanina, un aminoácido no esencial que es utilizado por el rumiante como una fuente de nitrógeno, carbono y energía (Datos aún no publicados). De esta manera, es probable que estos nitrocompuestos sean vistos de manera favorable por las agencias reguladoras de alimentos como una alternativa de solución para incrementar la eficiencia energética del rumiante a través de la disminución en la emisión de GEI. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar si la adición de ANP y de NO₃ en forma individual o combinada es capaz de reducir la metanogénesis sin ocasionar efectos adversos a la fermentación ruminal.
 

MATERIALES Y MÉTODOS

El experimento se desarrolló de acuerdo a la técnica descrita por Gutiérrez et al. (2008). El líquido ruminal se obtuvo en un tiempo menor a 30 min a partir de una vaca Jersey canulada ruminalmente y alimentada con pastura de rye grass bajo condiciones de pastoreo. Para el estudio se utilizaron tubos de cultivo de 18 x 150 mm. En cada uno se depositaron 9 mL de cultivo ruminal, 0.2 g de alfalfa molida y 1 mL de líquido ruminal fresco y filtrado en cuatro capas de tela. Todo el proceso se realizó bajo una atmosfera 100% anaerobia utilizando bióxido de carbono. Los tubos se cerraron con tapones de butilo y se aseguraron con aros de aluminio. En cada tratamiento se administraron volúmenes < 0.5 mL para evitar sesgos en los resultados finales incluyendo al control para igualar su volumen. Las soluciones madre se prepararon con ANP, NO₃ y agua destilada, ambas a una concentración de 400 µmol/mL. Finalmente, se incubaron a una temperatura de 39°C. Los tratamientos que se evaluaron fueron 0 µmol (controles), 4 µmol de ANP, 8 µmol de NO₃, 16 µmol de NO₃ y las combinaciones de 4 µmol de ANP con 8 µmol y 16 µmol de NO₃. Cada tratamiento se evaluó por triplicado. Después de 24 h de incubación, se midió el volumen total de gas mediante el desplazamiento de una jeringa lubricada de 30 cc. La concentración de los gases CH₄ e hidrógeno se midieron por cromatografía de gases (Allison et al., 1992). La concentración inicial y final de ANP, NO₃ y NO₂ obtenidas a las 0 h y 24 h se midieron mediante colorimetría (Cataldo et al., 1975; Majak et al., 1986; Schneider, 1973) así como la concentración de amoniaco (NH₄) (Chaney y Marbach, 1962). Los resultados se presentaron como µmol catabolizados. Los ácidos totales se midieron mediante cromatografía de gases (Lambert y Moss, 1972; Salanitro y Muirhead, 1975) y se expresaron como µmol producidos. Las pruebas de los efectos de los tratamientos se realizaron mediante un análisis de varianza en bloques completamente al azar y para detectar diferencias entre los tratamientos se calcularon las diferencias mínimas significativas (Statistix 10 Analytical Software, Tallahassee, Fl, USA).
 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este experimento se presentan en la tabla 1. En la tabla se observa que la producción de CH₄ disminuye (P < 0.05) en todos los tratamientos en > 96% en relación al control. Estos resultados son consistentes con los reportados anteriormente (Anderson y Rasmussen, 1998; Bo?ic et al., 2009) aunque la disminución fue notablemente menor en estos estudios. No se observó efecto (P > 0.05) de tratamiento sobre la concentración de hidrógeno, sin embargo la reducción en su concentración en la fase gaseosa fue < 50% en relación al control. Se observó un consumo > 95% de ANP cuando se administró de manera individual, mientras que en aquellos en los que se combinó con NO₃, se observó una notable disminución en su consumo < 17% en relación al control. Estos resultados sugieren que la reducción microbiana de NO₃ es termodinámicamente más favorable y por lo tanto preferida en relación al ANP. La cantidad de NO₃ administrada a los tratamientos en forma individual o en combinación con ANP fue consumida por los microorganismos ruminales casi en su totalidad (> 95%). Sin embargo, la acumulación de NO₂ en los tratamientos a los que se administró exclusivamente NO₃ y a los que se combinó con ANP osciló entre 3 y 12 µmol/mL las cuales representan 38% y 69% del NO₃ metabolizado, respectivamente. Se conoce que concentraciones de NO₂ mayores a 3 µmol/mL son tóxicas para los microorganismos del rumen tales como las metanogénicas y otras más teniendo como consecuencia una disminución en la fermentación ruminal (Iwamoto et al., 2002). Se observó un efecto (P < 0.05) sobre la concentración de ácidos totales, la cual se redujo en 32% con la administración de ANP y hasta 46% en combinación con NO₃ en relación al control. La proporción acetato:propionato se incrementó (P < 0.05) hasta 3 veces en relación al control. Este efecto se debe al incremento en la concentración de acetato y a la disminución de propionato (P < 0.05) sin importar la presencia de NO₃ o ANP. La concentración de formato fue de 2 µmol en el tratamiento al que se administraron 16 µmol de NO₃, sin embargo fue indetectable en los demás tratamientos. El balance de hidrógeno indica que la producción de agentes reductores durante la fermentación ruminal se redujo en todos los tratamientos, aunque este efecto fue mayor en los cultivos co-tratados. A pesar de la disminución en la producción de agentes reductores, una cantidad considerable de estos no se logró estimar en los demás tratamientos, debido a que únicamente se logró detectar hasta un 72% del total de los productos de fermentación. Estos resultados así como las estimaciones estequiométricas de la cantidad de hexosas fermentadas y la eficiencia de la fermentación revelan que la fermentación se inhibió en todos los tratamientos.

CONCLUSIÓN

La administración individual o combinada de NO₃ y ANP en los cultivos ruminales redujo sorprendentemente la producción de CH₄. Sin embargo, la administración de estos nitrocompuestos también redujo el proceso de fermentación ruminal, lo cual podría comprometer la fermentación en el rumiante. Estos resultados servirán como fundamento para continuar con las investigaciones respecto a los efectos de inhibición de nitrocompuestos sobre la metanogénesis ruminal con el fin de identificar aditivos alimenticios capaces de reducir la producción de CH₄ ruminal sin causar efectos adversos a la digestibilidad de la materia seca en el rumiante.
 

AGRADECIMIENTOS

Se agradece ampliamente a CONACYT por el apoyo económico que Alejandro Castañeda Correa recibió para realizar la estancia de investigación en USDA/ARS Southern Plains Agricultural Research Center en College Station, Texas, EUA.
 

REFERENCIAS

Allison, MJ, Mayberry, WR, McSweeney, CS, Stahl, DA. 1992. Synergistes jonesii, gen. nov., sp. nov.: a ruminal bacterium that degrades toxic pyridinediols. Systematic and Applied Microbiology. 15, 522-529.
 

Anderson, RC, Callaway, TR, Van Kessel, JS, Jung, YS, Edrington, TS, Nisbet, DJ. 2003. Effect of select nitrocompounds on ruminal fermentation; an initial look at their potential to reduce economic and environmental costs associated with ruminal methanogenesis. Bioresource Technology. 90, 59-63.
 

Anderson, RC, Carstens, GE, Miller, RK, Callaway, TR, Schultz, CL, Edrington, TS, Harvey, RB, Nisbet, DJ. 2006. Effect of oral nitroethane and 2-nitropropanol administration on methane-producing activity and volatile fatty acid production in the ovine rumen. Bioresource Technology. 97, 2421-2426.
 

Anderson, RC, Rasmussen, MA. 1998. Use of a novel nitrotoxin-metabolizing bacterium to reduce ruminal methane production. Bioresource Technology. 64, 89-95.
 

Bo?ic, AK, Anderson, RC, Carstens, GE, Ricke, SC, Callaway, TR, Yokoyama, MT, Wang, JK, Nisbet, DJ. 2009. Effects of the methane-inhibitors nitrate, nitroethane, lauric acid, Lauricidin® and the Hawaiian marine algae, Chaetoceros, on ruminal fermentation in vitro. Bioresource Technology. 100, 4017-4025.
 

Burns, JC, Cope, WA, Barrick, and ER. 1977. Cow and calf performance, per hectare productivity, and persistance of Crownvetch under grazing. Agronomy Journal. 69, 77-81.
 

Cataldo, DA, Haroon, M, Schrader, LE, Youngs, VL. 1975. Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Communication Soil Science Plant Analysis. 6, 71-80.
 

Chaney, AL, Marbach, EP. 1962. Modified reagents for determination of urea and ammonia. Clinical Chemistry. 8, 130-132.
 

EPA, 2006. Inventory of U.S. Greenhouse Gas Emissions and Sinks: 1990-2004. United States Environmental Protection Agency, Washington, DC. USEPA #430-R-06-002.
 

Gutierrez-Bañuelos, H, Anderson, RC, Carstens, GE, Slay, LJ, RamLachan, N,Horrocks, SM, Callaway, TR, Edrington, TS, Nisbet, DJ. 2007. Zoonotic bacterial populations, gut fermentation characteristics and methane production in feedlot steers during oral nitroethane treatment and after the feeding of an experimental chlorate product. Anaerobe. 13, 21-31.
 

Gutierrez-Bañuelos, H., Anderson, RC, Carstens, GE, Tedeschi, LO, Pinchak, WE, Cabrera-Diaz, E, Krueger, NA, Callaway, TR, Nisbet, DJ. 2008. Effects of nitroethane and monensin on ruminal fluid fermentation characteristics and nitrocompound-metabolizing bacterial populations. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 4650-4658.
 

Iwamoto, M, Asanuma, N, Hino, T. 2002. Ability of Selenomonas ruminantium, Veillonella parvula, and Wolinella succinogenes to reduce nitrate and nitrite with special reference to the suppression of ruminal methanogenesis. Anaerobe. 8, 209-215.
 

Johnson, KA, Johnson, DE. 1995. Methane emissions from cattle. Journal of Animal Science. 73, 2483-2492.
 

Lambert, MA, Moss, CW. 1972. Preparation and analysis of the butyl esters of short-chain volatile and non-volatile fatty acids. Advances in Chromatography. 74, 335-338.
 

Majak, W, Cheng, K-J., Hall, JW. 1986. Enhanced degradation of 3-nitropropanol by ruminal microorganisms. Journal of Animal Science. 62, 1072-1080.
 

Marais, JP, Therion, JJ, Macie, RI, Kistner, A, Dennison, C. 1988. Effect of nitrate and its reduction products on the growth and activity of the rumen microbial population. British Journal of Nutrition. 59, 301-313.
 

Salanitro, JP, Muirhead, PA. 1975. Quantitative method for the gas chromatographic analysis of short-chain monocarboxylic and dicarboxylic acids in fermentation media. Applied Microbiology. 29, 374-381.
 

Schneider, NR, Yeary, RA. 1973. Measurement of nitrite and nitrate in blood. American Journal of Veterinary Research. 34, 133-135.