¹Centro Nacional de Investigación Disciplinaría en Microbiología Animal, INIFAP.
²Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM.
³Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlán, UNAM.
⁴Posdoctorado, CONACYT-UNAM.
⁵Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, IPN.
⁶Facultad de medicina, UNAM.

Los primeros casos

La diarrea epidémica porcina (DEP) es una enfermedad emergente en el entorno de la porcicultura nacional. Se detectó por primera vez en el continente americano en el año 2013, específicamente en Estados Unidos de Norteamérica. En México, los primeros casos sospechosos se registraron en junio y julio de 2013, en la zona de la Piedad Michoacán. Se registraron pérdidas millonarias, principalmente asociadas a la alta mortalidad en cerdos lactantes, la cual llegó a ser de hasta el 100%. Los primeros clínicos en reconocer el cuadro gastroentérico requerían del diagnóstico diferencial con gastroenteritis transmisible (GET), sin embargo, existían en ese momento pocas herramientas disponibles. Una de las alternativas de diagnóstico que se empleó, fueron las pruebas rápidas por cromatografía en fase sólida. Estas pruebas, importadas de forma clandestina, ayudaron en gran medida, a diagnosticar los primeros casos de DEP en México. Posteriormente, se enviaron muestras al extranjero y mediante el apoyo de las universidades (principalmente de Minnesota y Iowa), se logró la confirmación mediante RT-PCR y posterior secuenciación. En ese momento en México se organizaba la Asociación de Mexicana de Veterinarios Especialistas en Cerdos (AMVEC), para poner a disposición de productores, médicos veterinarios, clínicos de campo y especialistas de laboratorio, información de actualidad acerca del tema. Con simposios y cursos, se distribuyó de forma acelerada información que confirmaba, cada vez más, la certeza del ingreso de la DEP en la porcicultura mexicana. Se conformó un grupo para apoyar a la SENASICA, en el abordaje de esta problemática. Los grupos de trabajo propusieron alternativas, sin embargo, un requisito indispensable para poder dar una declaratoria oficial de la presencia del virus de la DEP, fue establecer las condiciones para el aislamiento viral y otras técnicas de diagnóstico, por lo que el grupo de Virología del CENID-Microbiología Animal desarrolló proyectos de investigación, de los cuales se desprenden los resultados que a continuación se presentan.

Diagnóstico diferencial

Como primer abordaje, en el año 2013, se establecieron pruebas moleculares para el diagnóstico del vDEP, y diagnóstico diferencial del vGET, de Rotavirus A (RoV-A) y del Deltacoronavirus porcino (DCoV). Con el uso de una RT-PCR se diagnosticó la presencia del vDEP y DCoV en muestras colectadas en el año 2013 y 2014. Los resultados se presentan en el Cuadro 1.
 

Con los datos obtenidos se confirmaba la circulación del vDEP y su asociación con los brotes de diarreas presentes en las granjas porcinas. Un resultado destacable fue la positividad para DCoV, mismo que fue reportado a principios de 2014 en Estados Unidos (aunque su presencia fue detectada desde 2013, en estudios retrospectivos).

Diagnóstico confirmatorio y caracterización molecular del gen Spike del vDEP

Una vez identificado el vDEP, se procedió a confirmar el diagnóstico mediante pruebas específicas para discriminar cepas virulentas o variantes. Esta prueba molecular, se desarrolló mediante la RT-PCR en tiempo real. Con el uso de una sonda específica que hibrida en una región conservada para cepas virulentas y una sonda para cepas variantes, se puede realizar el diagnóstico confirmatorio y se obtiene información valiosa para identificar el tipo de cepa circulante. De un total de 116 muestras analizadas, 103 (88.8%) resultaros positivas a vDEP. El 87.4% de las muestras positivas correspondieron a cepas virulentas y el 12.6% a cepas variantes o tipo INDEL (con inserciones y deleciones en el gen Spike). Se seleccionaron 10 muestras, de las cuales se amplificó y secuenció el gen Spike completo. Las secuencias pertenecen a seis estados de México. El alineamiento se realizó utilizando secuencias previamente reportadas pertenecientes al G1a, G1b, G2a, G2b e INDEL, para comparar las secuencias obtenidas en el presente estudio. Mediante el alineamiento de aminoácidos se realizó el análisis de los epítopes neutralizantes. En la región COE se determinó que respecto a la cepa USA/Colorado/2013 existen mutaciones en siete de las diez cepas analizadas, sin embargo, los epítopes SS2, SS6 y 2C10 se mantiene conservados. Se identificó una inserción de tres aa (238LGL240) en dos cepas identificadas en Jalisco en el año 2016. El alineamiento permitió identificar que de acuerdo a los genogrupos existen cambios en residuos específicos, lo que podría tener una implicación importante en el reconocimiento de anticuerpos para diversas cepas. (Revisar: Lara-Romero, R., Gómez-Núñez, L., Cerriteño-Sánchez, J.L. et al. Virus Genes (2018) 54: 215. https://doi.org/10.1007/s11262-017-1528-x).

Aislamiento del vDEP en cultivos celulares

Como se comentó anteriormente, el aislamiento viral permitió que se realizara la declaratoria oficial de la presencia del vDEP en el territorio nacional y que fuera modificada la lista de enfermedades de notificación obligatoria, considerando al vDEP en la lista 3, en donde se encuentran las enfermedades endémicas. El reconocimiento oficial y el cambio de estatus en el listado, permite a los diversos actores tomar medidas más efectivas, en la actualidad se puede desarrollar investigación aplicada que provea alternativas en diagnóstico y en el desarrollo de biológicos, así mismo permite el ingreso de vacunas disponibles en mercados extranjeros. Por lo que resulta en un beneficio para el productor. En el laboratorio de Virología del CENID-Microbiología animal, del INIFAP, se han desarrollado y modificado protocolos de aislamiento viral. El primoaislamiento es frecuente y no conlleva una gran dificultad, sin embargo, mantener la infectividad del vDEP en cultivos, requiere de estrategias diversas para lograr la replicación. En relación a esto, el uso de enzimas proteolíticas en los medios de cultivo permite realizar modificaciones en la proteína Spike del vDEP, lo que activa su infectividad. Sin embargo, la actividad proteolítica de estas enzimas puede ser perjudicial para los cultivos, por lo que optimizar la concentración y tiempos de incubación son indispensables para lograr el objetivo. A partir de muestras de campo y de infecciones experimentales se ha establecido un protocolo de infección en cultivos de células Vero empleando diversas enzimas proteolíticas, los resultados obtenidos indican que esta estrategia es más efectiva que mediante el uso exclusivo de tripsina, por lo que se ha convertido en una alternativa para realizar el aislamiento viral y mantener la infectividad a través de los pases en cultivo celular. En la Figura 1 se presenta el efecto citopático identificado en células Vero y una micrografía obtenida en microscopio electrónico de transmisión, en donde se observan morfologías virales parecidas a Coronavirus.
 

Desarrollo de una RT-PCR cuantitativa y validación con cepas mexicanas

Para realizar el diagnóstico cuantitativo se desarrolló una RT-PCR en tiempo real cuantitativa, para ello se empleó la información obtenida en la caracterización molecular del gen Spike. Se diseñaron un par de iniciadores y una sonda específica de una región conservada, lo que aseguró la detección de las diferentes cepas circulantes y detectadas en México por nuestro grupo de trabajo. La validación se realizó amplificando las diferentes cepas caracterizadas y mediante un estudio experimental. En el estudio experimental se emplearon muestras de lechones infectados con cepas virulentas y variantes. La prueba presentó un límite de detección de 3 y 4 copias de ARN del vDEP por reacción (para cepas virulentas y variantes, respectivamente). La sensibilidad y especificidad analítica, empleando las muestras experimentales, resultó en un 94 y 75 %, respectivamente.

Desarrollo de proteínas recombinantes del vDEP para su uso en pruebas serológicas

Para determinar las regiones de la proteína S con mayor potencial para ser producidas de manera recombinante, se usaron los algoritmos de Kyte y Doolittle, Jameson-Wolf y Kolaskar y Tongaonkar para predecir la región de anclaje a la membrana y los sitios potencialmente antigénicos. Finalmente, la probabilidad de que una región determinada se encuentre en la superficie de la proteína se evaluó mediante el enfoque de Emini. Dentro de los resultados encontrados; la secuencia de aminoácidos de la proteína S de USA/Colorado/2013 presenta las regiones S1 (1-789 a.a) y S2 (790-1383 a.a) y tal como se ha descrito previamente, la región S1 posee dos dominios, el dominio N-terminal (NTD) que se encuentra posicionado en los 9-433 residuos de aminoácidos (a.a.) y el dominio de unión al receptor C-terminal (RBD) en los 490-615 a.a. La posición de los epítopos antigénicos conocidos como ?centrales? SS2 (751-758 a.a.) y SS6 (767-774 a.a.) se encontraron en la región del epítopo antigénico S1D5-S1D6 (744-771 a.a.). Por lo tanto, se decidió expresar una región correspondiente al dominio N-terminal truncado (NTD) de la proteína S, que incluye la región expuesta de la proteína que interactúa con el receptor celular, a la cual denominamos NTD(1135). Por otra parte, se expresó otra región que incluye las regiones del epítopo S1D5-S1D6 con los epítopos conocidos como centrales SS2 y SS6 (678-953 a.a.), al cual denominados S1D (834). De acuerdo con la predicción antigénica, NTD(1135) tiene al menos 14 regiones potencialmente inmunogénicas, el RBD contiene 7 y S1D(834) contiene por lo menos 10 epítopos, distribuidos a lo largo de la región S1, conformando la región de mayor índice antigénico en la proteína Spike. Por otra parte, se encontró otra región potencialmente antigénica en el C-terminal de S2 correspondiente a aproximadamente los 1100-1300 a.a. La escala de hidrofobicidad de Kyte y Doolittle mostró una región transmembrana (TM) a través de la cual la proteína se ancla a la membrana del virus, que corresponde a 1328-1350 a.a. Esta región se descartó para su expresión en el sistema de E. coli debido a problemas futuros con la solubilidad de la proteína recombinante, además; en esta región no se encontró regiones antigénicas. Por último, la proteína Spike presenta pocas regiones con probabilidad de exponerse a la superficie en la estructura terciaria, se encontró un bajo índice de probabilidad en el NTD (1135) y S1D(834), inesperadamente; la región del C-terminal de S2 (1100-1300 a.a.) tiene la mayor región de probabilidad de ser expuestos en la superficie de la proteína S.

La secuencia de las proteínas NTD(1135) y S1D(834) derivadas del gen S se amplificó usando como plantilla los vectores pJET-NTD(1135) y Topo-S1D(834). Después de la ligación de los genes NTD(1135) y S1D(834), se analizó la orientación correcta de los insertos en los plásmidos recombinantes mediante restricción enzimática, PCR y secuenciación. Por último, los plásmidos recombinantes que sobre producen las proteínas recombinantes se denominaron pETSUMO-NTD(1135) con 6778 pb y pETSUMO-S1D (834) con 6477 pb. El sistema de expresión produce proteínas recombinantes fusionadas a la etiqueta de 6 his para permitir su purificación por cromatografía de afinidad IMAC y la proteína SUMO para potenciar la sobreexpresión, todo bajo inducción de IPTG. Se usaron los vectores pETSUMO-NTD(1135) y pETSUMO-S1D(834), para la transformación de células competentes BL21 (DE3). Las proteínas producidas han sido purificadas y se han realizado ensayos de reconocimiento antigénico mediante Western blot y ELISA, obteniendo resultados favorables.

Estos desarrollos se han realizado con el apoyo de Ingenieros en biotecnología y en Bioquímica, estas dos ramas de las ciencias de la vida son indispensables cuando se abordan problemáticas diversas como la emergencia de enfermedades, en este caso, la diarrea epidémica porcina. Nuestro grupo de trabajo continúa trabajando, actualmente en el desarrollo de un biológico que permita generar inmunidad en hembras y así proteger a las camadas susceptibles. La DEP ha dejado en evidencia que se debe trabajar de forma acelerada y con distintos enfoques para lograr el éxito en el control y posible erradicación de enfermedades que impactan económicamente a los porcicultores.