Resumen

Uno de los grandes problemas a nivel mundial es el abastecimiento de carne de cerdo. Debido a esto, se han implementado nuevas técnicas de reproducción animal como, el uso extractos naturales de Cymbopogon citratus (Cc) e Hypericum perforatum (Hp) disminuyendo la apoptosis celular provocada por los radicales libres en los espermatozoides y, nanopartículas de plata (AgNPs) como agente antimicrobiano debido a, la resistencia bacteriana generada por el uso indiscriminado de los antibióticos comúnmente utilizados a lo largo de los años, observando problemas reproductivos una vez inseminada la cerda, así como la propagación de enfermedades por semen contaminado. Por tal motivo, se propone utilizar dichas NPs para evaluar la concentración máxima sin provocar cambios morfológicos y estructurales en la membrana del espermatozoide.

A pesar de las investigaciones realizadas sobre extractos naturales y AgNPs por separado, se consideró necesario realizar el presente estudio; el cual brindará información sobre qué tan favorecedor es la utilización de extractos naturales y AgNPs en el área de producción porcina, puesto que, se tiene como objetivo fundamental la protección de los espermatozoides de agentes externos, como bacterias y macrófagos dentro del tracto reproductor de la hembra y, teniendo como resultado un menor porcentaje de daños estructurales en los espermatozoides debido a su manejo, manteniendo una mayor viabilidad y una mejor motilidad. De esta manera se favorecerá la relación beneficio-costo en los protocolos de reproducción asistida en cerdos.

Dichas nanopartículas fueron sintetizadas mediante química verde y el método Turkevich. Los extractos naturales se caracterizaron por DPPH* y HPLC para determinar la capacidad antioxidante y azúcares totales. Las AgNPs se caracterizaron mediante espectroscopía ultravioleta-visible, dispersión dinámica de luz, microscopía electrónica de barrido y transmisión. La actividad antimicrobiana se determinó mediante el método de difusión en pozos de agar en Luria Bertani contra Staphylococcus aureus y Pseudomona spp., se cultivaron cepas de E. coli y Salmonella typhimurium en caldo de soja tríptica y Clostridium perfringens en caldo de tioglicolato. La viabilidad seminal se analizó mediante dos métodos: sistema de calidad seminal y colorante eosina-nigrosina. Los resultados para el uso de extractos con semen se obtuvieron realizando una comparación con un diluyente a corto plazo, obteniendo como resultado para Cc una viabilidad de 66% vs 63% y, para Hp 82% vs 63%. Para las soluciones mezcladas con AgNPs con un tamaño de 20 a 100 nm se obtuvo una viabilidad arriba del 80% para los tres casos. Todas las muestras de AgNPs mostraron inhibición bacteriana. Se puede concluir que, al usar estos extractos naturales y AgNPs fue posible mantener la viabilidad de los espermatozoides durante 72 horas en almacenamiento, con un porcentaje de espermas normales arriba del 70%.

2. Materiales y Métodos

2.1. Animales experimentales y recolección de las dosis seminales

Se utilizó un semental Yorkshire de 3 años con un peso de 349 kg, el cual se alojó en un corral de 51 m2 con piso de cemento, provisto de sombra, bebedero y comedero, donde se le ofreció agua potable a libre acceso y alimento comercial dos veces por día (PIC, 2015). Por otro lado, para observar la morfología del espermatozoide se utilizó un Microscopio de Fuerza Atómica marca Nanosurf Easycan 2 AFM, así como, se realizaron pruebas para la evaluación macro y microscópica de dichos espermatozoides. 
 

2.2 Síntesis de las muestras

2.2.1 Síntesis de los extractos naturales
 

Para el desarrollo de la infusión del extracto de Cymbopogon Citratus se realizó un comparativo entre dos marcas comerciales diferentes (Lagg’s® y McCormick^®). La planta de Hypericum perforatum fue adquirida de un vivero local, la cual fue cultivada sin el uso de fertilizantes ni plaguicidas. Posteriormente, se seleccionó únicamente la flor dejándola secar durante 15 días consecutivos a temperatura ambiente.

Dichos extractos, se realizaron colocando 1.5 g de Cymbopogon citratus y, 1 g de Hypericum perforatum respectivamente en 60 mL de agua bidestilada a una temperatura de 50 °C durante 30 minutos evitando la pérdida de su poder antioxidante. Posteriormente, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora aproximadamente.

Las pruebas antioxidantes de los extractos naturales se realizaron mediante DPPH* (2,2-difenil-1- picrylhydrazyl), así como, la evaluación de azúcares totales mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).
 

2.2.2 Interacción de extractos naturales con semen porcino

Se prepararon veintisiete (n=3) soluciones de 5 mL de semen fresco sin diluir en viales de vidrio a temperatura ambiente, a las cuales se le agregaron tres diferentes concentraciones (0.250, 0.125 y 0.0625 µL) de extractos naturales y BTS. T1= BTS 0.250 µL, T2= BTS 0.125 µL, T3= BTS 0.0625 µL, T4= Cc 0.250 µL, T5= Cc 0.125 µL, T6= Cc 0.0625 µL, T7= Hp 0.250 µL, T8= Hp 0.125 µL y T9= Hp 0.0625 µL. Finalmente, las muestras fueron almacenadas a 17 °C durante 3 días consecutivos y, analizadas cada 24 horas, termalizando las  muestras  en  baño  María  hasta  llegar  a  una  temperatura  de  37  ?C gradualmente, mediante un Analizador de Calidad Seminal (SQS).

2.2.3 Síntesis de Nanopartículas de plata (AgNPs)

Para las soluciones de plata se emplearon 25 mL de agua bidestilada a una concentración 1 mM de nitrato de plata. Se utilizaron vasos de precipitado recubiertos con aluminio para evitar que la radiación electromagnética interfiera con el proceso de reducción (Lomelí- Rosales et al., 2019). Se mantuvo en agitación constante a 50 ºC mientras que, al inicio se agregaron 300 µL de Cymbopogon citratus y, 100 µL de Hypericum perforatum. Pasados 5 minutos se adicionaron 100 µL de ambos extractos respectivamente hasta que, las muestras cambiaron su color de transparente a color ámbar. Finalmente, se dejaron en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente y sin agitación.

Por otro lado, se realizó la síntesis de AgNPs mediante síntesis química, como grupo testigo. Se realizó una solución mediante citrato de sodio como agente reductor con una concentración 2 mM en 25 mL de agua doblemente desionizada y, nitrato de plata a una concentración 1 mM. Se sometió a 80 ºC durante 30 minutos, obteniendo la coloración característica de las soluciones de AgNPs, color ámbar.

Para la evaluación del tamaño y morfología de dichas NPs, se llevó a cabo mediante Espectrometría ultravioleta-visible (Uv-Vis) (Thermo Scientific modelo Genesys 10S), dicha técnica es utilizada como prueba rápida para confirmar la reducción de las NPs, se utilizó un equipo Zetasizer Nano S, para la obtención de distribución del tamaño de las AgNPs mediante dispersión dinámica de luz (DLS), las características morfológicas de las muestras se realizaron por medio de un Microscopio electrónico de barrido (SEM); marca Tescan® modelo MIRA 3 LMU de alta resolución y, el Microscopio Electrónico de transmisión (TEM) marca JEOL JSM-1010.
 

2.2.4  Interacción de AgNPs con semen porcino
 

Para dicho análisis se prepararon veintisiete (n=3) soluciones de 5 mL de semen diluido en viales de vidrio a temperatura ambiente, a las cuales se le agregaron AgNPs sintetizadas con extracto de Cymbopogon citratus (Cc), Hypericumm perforatum (Hp) y, Citrato de sodio a tres diferentes concentraciones (0.1, 0.5 y 1 µL). T1= Citrato 0.1 µL, T2= Citrato 0.5 µL, T3= Citrato 1 µL, T4= Hp AgNPs 0.1 µL, T5= Hp AgNPs 0.5 µL, T6= Hp AgNPs 1 µL, T7= Cc AgNPs 0.1 µL, T8= Cc AgNPs 0.5 µL y T9= Cc AgNPs 1 µL. Finalmente, las muestras fueron almacenadas a 17 °C y, durante 3 días consecutivos y, analizadas cada 24 horas, termalizando  las  muestras  en  baño  María  hasta  llegar  a  una  temperatura  de  37  ?C gradualmente, mediante un Analizador de Calidad Seminal (SQS).
 

2.3 Pruebas antimicrobianas de AgNPs y extractos naturales
 

Se preparó 1 L de medio de cultivo a utilizar. Se colocó aproximadamente 50 mL de dicho agar junto con 300 µL del inóculo con las correspondientes cepas, en este caso, S. aureus y P. spp. Por último, se vertieron 25 mL en cajas Petri de cada solución con las distintas cepas, se hicieron cinco pozos y uno de control, en los cuales se mezclaron 60 µL de los diferentes sistemas previamente sintetizados (Cymbopogon citratus, Hypericum perforatum, Cymbopogon citratus con AgNPs, Hypericum perforatum con AgNPs y AgNPs con citrato de sodio), finalmente, se enfriaron para gelificar, se taparon y se mantuvieron en refrigeración (4°C) durante 12 horas para su posterior uso y evaluación bactericida. Por otro lado, se prepararon cultivos líquidos de las cepas de referencia puras E. coli (ATCC 25922), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) en caldo soya tripticaseína y Clostridium perfringens (ATCC 13124) en caldo tioglicolato. A partir de este cultivo se preparó una suspensión bacteriana de cada bacteria ajustando la concentración a 0.5 McF (1 x10⁸ UFC/mL) en diluyente de peptona. Esta suspensión bacteriana se  expuso  a  una  concentración de  100  mg/mL  de las diferentes infusiones (Cymbopogon citratus e Hypericum perforatum) y AgNPs preparadas a partir de las infusiones Cymbopogon citratus AgNPs, Hypericum perforatum AgNPs y Citrato de sodio AgNPs, así como con el diluyente comercial BTS.
 

3. Resultados y discusión 

3.1 Evaluación de las dosis seminales mediante un Analizador de Calidad Seminal (SQS)
 

Todas las muestras seminales recién recolectadas fueron analizadas mediante el equipo SQS obteniendo un promedio del 86% de todas las muestras empleadas en esta investigación, de las cuales se seleccionaron aquellas que su porcentaje de viabilidad fuera arriba del 70%, puesto que, según lo reportado por Del Valle Rodríguez, (2017) dicho porcentaje es el mínimo aceptable para considerar una dosis seminal adecuada.

3.2 Análisis de la morfología del espermatozoide mediante AFM

Dicha técnica innovadora es capaz de mostrar una morfología precisa, así como una estructura en 3-D sin dañar al espermatozoide, lo cual permite obtener información de en un nivel sub-molecular. En la Figura 1a se observa la imagen de un espermatozoide porcino obtenido mediante dicha técnica, el cual tiene un largo de la cabeza de 8.7 µm coincidiendo con lo reportado por Rubessa et al., (2020) (9.17 ± 0.44 µm), sin embargo, se encontraron algunas diferencias en cuanto al ancho debido a que, dichos autores reportaron un promedio de 4.55 ± 0.33 µm, lo cual difiere con lo observado en la presente investigación siendo de 5.2 µm, mientras que, su altura fue de 0.8 µm, no obstante, no fue posible corroborar esta última medición, ya que no existen reportes en la literatura (Figura 1b). Finalmente, en la Figura 1c se muestra la imagen completa de un espermatozoide mediante la cual se pudo determinar que su largo es de 46 µm.

3.3. Pruebas antioxidantes de los extractos naturales mediante DPPH* (2,2- difenil-1-picrylhydrazyl)

Para el extracto de Hypericum perforatum, el cual tardó aproximadamente 20 minutos en estabilizarse llegó a un 86% de inhibición, lo que indica una mayor estabilidad en un menor tiempo, lo cual coincide con lo reportado por Silva et al., en 2004. En comparación con Cymbopogon citratus, el cual tardó 40 minutos para estabilizarse llegando a un 82% de inhibición. Es por esto que, al mostrar un porcentaje de inhibición arriba del 80% se convierten en una nueva alternativa para su uso como conservadores seminales, debido a su propiedad para reducir RL (radicales libres), los cuales los hace altamente reactivos atacando moléculas biológicas, tal es el caso del espermatozoide porcino, causando apoptosis celular a consecuencia del proceso de oxidación alterando la membrana plasmática (Güzel et al., 2019).

3.4. Determinación de azúcares totales de los extractos naturales mediante HPLC (Cromatografía líquida de alta eficacia)

Para el extracto de Hypericum perforatum, la concentración tanto de glucosa como de fructosa en la flor deshidratada de dicha planta se encontraron por debajo del límite de cuantificación, lo cual coincide con lo reportado por Martínez-Solís, (2015), en donde se reporta que el máximo contenido de azúcares de esta planta se localiza en los tallos con un 0.0004%. Por otro lado, para Cymbopogon citratus el contenido de fructosa no fue relevante debido a sus bajas concentraciones, sin embargo, para glucosa se obtuvieron 0.558 g/L, la cual es ligeramente menor de la cantidad reportada en la ficha técnica de la hierba comercial. Dichos extractos, fueron diluidos y suplementados en concentraciones especificas a las fracciones seminales establecidas midiendo su viabilidad durante 72 horas consecutivas.

3.5 Análisis de viabilidad de semen porcino en presencia de extractos naturales

En el cuadro 1 se muestran los diferentes tratamientos con sus tres concentraciones cada uno, medidos mediante SQS, en donde para el tiempo 0 h T6 (90±2.65) muestra diferencia significativa (P<0.05) en comparación con todos los demás tratamientos, debido a que, es el porcentaje más alto de viabilidad espermática. Por otro lado, a las 48 h el porcentaje con mayor viabilidad fue para T5 (85±1.73) mostrando diferencia significativa (P<0.05) en comparación con todos los demás tratamientos. Para los tiempos de 24 y 72 h no se observaron diferencia significativa (P > 0.05) en todos los tratamientos.

Los resultados mostraron que los extractos naturales pueden emplearse como preservadores de semen de cerdo, debido a que, logran mantener una viabilidad espermática apta en la misma proporción que los diluyentes comerciales, siendo una alternativa de menor costo y de fácil acceso.

3.6 Caracterización mediante Espectroscopía Ultravioleta Visible (UV- vis) y Dispersión Dinámica de Luz (DLS).

La síntesis de AgNPs coloidales mediante Hypericum perforatum, Cymbopogon citratus y el método de Turkevich adquirieron una coloración ámbar, característica de las soluciones coloidales de AgNPs.

Para las AgNPs con Hypericum perforatum se observó un pico de máxima absorbancia de 438 nm en el primer día en comparación con lo reportado con Ajayi et al., (2017), los cuales observaron un pico de máxima absorbancia en 455 nm, dicha diferencia puede ser debida a la metodología empleada en las síntesis. Por otro lado, el tercer día disminuyó a 433 nm, lo que indica un corrimiento al azul.  Se muestra una intensidad máxima de absorbancia en 430 nm a las 24 horas, lo cual coincide con lo reportado por Gitea et al., (2020), mientras que, mientras que, pasadas las 72 horas se observó un pico a los 433 nm. Este desplazamiento hacia el rojo está relacionado con un ligero crecimiento en el tamaño de las NPs (Smith et al., 2008) De acuerdo con la simetría que tienen ambas curvas, se puede determinar que para las NPs sintetizadas con Cymbopogon citratus, existe una distribución de tamaño de partícula más estrecha en comparación con las partículas reducidas con Hypericum perforatum. Finalmente, se pudo observar el análisis de la muestra de AgNPs reducidas con citrato de sodio, donde, el pico de máxima absorbancia para el primer día fue de 424 nm y, pasadas las 48 horas cambió a 422 nm. En referencias encontradas en la literatura se reporta que, el pico de máxima absorción para dichas NPs mediante síntesis química se encuentra alrededor de 424 nm (Mazzonello et al., 2017).

La determinación de la distribución del tamaño de las AgNPs se llevó a cabo mediante la técnica de DLS. Se puede observar que, para la síntesis de NPs con Hypericum perforatum como agente reductor existe un comportamiento bimodal de la distribución de tamaños, que se puede relacionar con el ancho de los espectros de UV-vis, con una campana que va de 4 a 20 nm y una segunda campana de 30 a 120 nm, lo cual se corrobora con lo reportado por Tortella et al., (2018); mientras que, las AgNPs sintetizadas mediante Cymbopogon citratus, muestran un estrecho rango de distribución de tamaños que va de los 60 a los 105 nm.

3.7 Análisis de AgNPs con extractos naturales mediante SEM y TEM
 

Para corroborar el tamaño y morfología de dichas AgNPs sintetizadas con los diferentes sistemas, se llevó a cabo el análisis mediante SEM. El tamaño de las partículas para todos los sistemas fue menor a los 100 nm.

Debido a que, SEM es una técnica de baja energía no permite determinar los tamaños precisos de las NPs, es por esto que, fue necesario realizar TEM para la obtención del tamaño y morfología de estas, para dicho análisis se emplearon 100 mil y 200 mil magnificaciones.

En la Figura 3a y 3b, se muestran las micrografías de las NPs sintetizadas mediante Hypericum perforatum con una distribución bimodal y un tamaño de partículas en un rango que va de los 20 a los 50nm aproximadamente. En la Figura 3c y 3d se observan NPs de Cymbopogon citratus con un tamaño menor a los 10 nm, lo cual no se observó en el análisis mediante DLS. Sin embargo, la mayoría de ellas cuentan con un tamaño entre los 10 y 60 nm. Por otro lado, en la Figura 3e y 3f se obtuvieron NPs con citrato de sodio con un tamaño entre 30 y 60 nm. Todas las NPs mostraron una morfología semiesférica y una distribución de tamaño bimodal, lo que no afecta a sus propiedades antimicrobianas.
 

3.8 Efecto bactericida

En la presente investigación se utilizaron dos métodos para determinar la inhibición bacteriana de los diferentes sistemas sintetizados, en primera instancia, la técnica de pozos que proporciona información cualitativa. En este caso, se eligieron dos cepas bacterianas, Pseudomonas spp (Gram^-) y Staphylococcus aureus (Gram⁺). Se analizaron las propiedades antibacterianas de las soluciones de NPs, mostrando zonas de inhibición frente a S. aureus con un radio de 0.56 cm para AgNPs con Hypericum perforatum mientras que, el radio de la zona de inhibición formada por AgNPs con Cymbopogon citratus alcanzó 0.61 cm. La inhibición contra Pseudomona spp. con un radio de 0.51 cm para AgNPs sintetizadas con Hypericum perforatum y 0.49 cm para NPs sintetizadas con citrato de sodio. Para los extractos naturales y la solución con citrato de sodio no existió un halo de inhibición para ambas cepas.

Por otro lado, se realizó un estudio cuantitativo para observar la actividad antibacteriana frente a un número específico de UFC / g con un tiempo definido por contacto cuando, las bacterias se encuentran en una fase de crecimiento activo. La inhibición de los extractos naturales y las AgNPs se llevó a cabo en tres cepas diferentes, E. coli, Salmonella thypimurium y Clostridium perfringes mediante el método de extensión de placa y se comparó la eficacia de los diluyentes para el semen de cerdo. Los análisis de las muestras mostraron que, los extractos naturales, AgNPs y, el diluyente comercial al entrar en contacto con la infusión, disminuyen el logaritmo de UFC / mL en comparación con el grupo control (sin agente antimicrobiano) en el caso de E. coli y Salmonella thyphimurium. Las NPs disminuyen dos logaritmos en comparación con el control en la cepa de Salmonella más no en el caso de E. coli donde, sólo se observó una disminución de un logaritmo de concentración. BTS logró disminuir un logaritmo de concentración de E. coli, mientras que, para Salmonella no muestra un efecto sobre el crecimiento logarítmico. En el caso de Clostridium perfringens, se observó que al contacto con las AgNPs hay una disminución en dos logaritmos de las UFC / mL al igual que con las infusiones en comparación con el control. En el caso de los extractos naturales, no se observó una disminución del logartitmo en Clostridium perfringes en comparación con Salmonella thypimurium y E. coli.

3.9 Estudio de la viabilidad de espermatozoides porcinos en presencia de AgNPs

En el cuadro 2 se muestran los porcentajes de viabilidad espermática para los diferentes tratamientos con sus tres variantes en las concentraciones de AgNPs, en los cuales no se observaron diferencias significativas (P> 0.05) en el periodo de estudio

4. CONCLUSIONES

Se establecieron las concentraciones adecuadas de los extractos de Hypericum perforatum y Cymbopogon citratus en interacción con los espermatozoides porcinos, observándose que, para Hypericum perforatum se mantuvo una viabilidad seminal arriba del 70% para sus tres concentraciones en un periodo de tiempo de 72 horas en comparación con, Cymbopogon citratus, el cual tuvo un porcentaje de espermatozoides normales superior al 83% en el mismo lapso de tiempo para sus múltiples concentraciones, siendo superiores ambos porcentajes en comparación con el uso del BTS.

Las propiedades antimicrobianas de los extractos naturales mostraron efectos positivos contra las cepas de E. coli, Salmonella thypimurium y Clostridium perfringes, causantes de la apoptosis celular y, daños en la membrana espermática debido a que, la temperatura para la preservación seminal favorece el crecimiento de dichas bacterias.

Las propiedades antimicrobianas mostraron que, las AgNPs reducidas mediante citrato de sodio e Hypericum perfotatum inhibieron mayor concentración bacteriana en las diversas cepas empleadas.

Se determinaron las concentraciones adecuadas de AgNPs necesarias para mantener una viabilidad seminal en un periodo de 72 horas, en donde, se observó que, para las tres soluciones en sus diferentes concentraciones se obtuvo un porcentaje superior al 80%, manteniendo un porcentaje de espermatozoides normales mayor al 80% de igual manera, siendo aptas para su uso en protocolos de inseminación artificial.

5.    LITERATURA CITADA

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