Yair Roman López García¹, Sergio Gómez Rosales², María de Lourdes Angeles², Rubén Merino Guzmán³, Guillermo Téllez Isaías⁴.

¹UNAM, FES-Cuautitlán, México, ²CENID Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP, Ajuchitlán, Querétaro, México, ³Departamento de Medicina y Zootecnia de Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. México, ⁴Department of Poultry Science, University of Arkansas, Fayetteville, USA.
 

Resumen
 

Se utilizaron 90 pollos machos alojados en jaulas individuales del día 14 al 38 de vida. El experimento consistió en dos etapas. La primera etapa del día 14-28 considerada de bajo desafío, con tres tratamientos: 1 = dieta basal (maíz blanco y pasta de soya) con APC, 2 = dieta basal sin APC (SAPC), 3= dieta basal con 0.3% SH. La segunda etapa fue del día 28-38 días, donde se mantuvieron los mismos tres tratamientos descritos, pero provocando cambios morfológicos mediante desafíos dietéticos. Al día 28, la dieta basal se dividió en dos agregando A) granos secos de destilería con solubles (DDGS), y B) agregando maíz azul y DDGS. Al día 37, las dietas A y B se intercambiaron dentro de cada tratamiento provocando un segundo desafío. Al día 28, 29 y 38 del experimento, seis pollos de cada tratamiento fueron sacrificados para la toma de muestras. Los resultados fueron sometidos a análisis de varianza. Del día 14-38, la conversión alimenticia fue menor con SH y APC respecto a SAPC (p <0.05). En condiciones de no desafío, los APC y las SH disminuyeron el área aparente de las vellosidades del yeyuno respecto a SAPC (p < 0.05); lo observado en la morfología se reflejó con el número de células caliciformes neutras, ácidas sulfatadas y ácidas no sulfatadas (p <0.05). Al día 29, después del primer desafío, las SH no evitaron la atrofia de las vellosidades del yeyuno, pero aumentaron el número de células caliciformes, en comparación con SAPC (p <0.05). Al día 38, después del segundo desafío, no se observaron cambios sustantivos entre tratamientos en la morfología y número de células caliciformes en las vellosidades. Este es el primer estudio que demuestra que en condiciones de bajo desafío las SH tienen un efecto similar a los APC en la histología y número de células caliciformes en las vellosidades. Después de un desafío, las SH no evitan la atrofia de la mucosa del yeyuno comparadas con APC, pero son capaces de inducir una respuesta compensatoria parcial en el número de células caliciformes productoras de mucinas.
 

Introducción 

La demanda creciente de productos alimenticios seguros y libres de residuos de antibióticos promotores del crecimiento (APC) ha generado a nivel mundial la necesidad de desarrollar alternativas a los antibióticos en la alimentación animal [1], con la finalidad de evitar la resistencia bacteriana en los animales y la resistencia cruzada en humanos [2, 3, 4, 5]. Actualmente hay productos alternos a los APC que pueden estimular el sistema inmunológico del tracto intestinal, que pueden ayudar a conservar y a fortalecer la microbiota benéfica, o a reducir los efectos de microorganismos patógenos; todos con el objetivo de promover la salud y maximizar el potencial productivo de los animales [6, 7, 8, 9, 10]. Sin embargo, una de las alternativas que está tomando fuerza es el uso de sustancias húmicas (SH), que son mezclas complejas y heterogéneas de materiales polidispersos formados en suelos, sedimentos y aguas naturales por reacciones bioquímicas y químicas durante la descomposición y transformación de restos vegetales y microbianos (un proceso llamado humificación) [11]. La formación de SH es un proceso complejo en donde la actividad microbiana, la temperatura, el pH, el contenido de humedad y de oxígeno interactúan entre sí [12]. Las SH están integradas por concentraciones relativas de ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y huminas, y dependiendo de la materia prima de donde se obtengan la concentración de sus componentes será variable [13, 14]. Las SH tienen la capacidad de mejorar la digestibilidad ileal de la energía y la retención de nutrientes [15], mejorar la tasa de conversión alimenticia [16], aumentar la actividad de las enzimas digestivas [6], incluso, tienen un efecto trófico sobre las vellosidades intestinales [6, 16, 17, 18], con lo que podría explicarse el alto rendimiento del crecimiento, la mejor utilización de nutrientes y la fijación de minerales en hueso [16, 17]. También ayudan a reducir significativamente los efectos inmunotóxicos de las aflatoxinas [19]. En condiciones de estrés oxidativo se ha visto que ayudan a reducirlo y a mejorar la calidad de la carne [20]. También ayudan a favorecer el rendimiento de la canal y al número de bacterias ácido-lácticas [14]. Sin embargo, aún se sigue esclareciendo la forma en cómo actúan en el tracto gastro intestinal. Kühnert et al. 1991 [21], sugieren que las SH pueden crear una película protectora en la membrana mucosa del epitelio intestinal, ayudando a reforzar la barrera epitelial contra infecciones y sustancias tóxicas; incluso podrían reducir o prevenir la reabsorción de metabolitos tóxicos gracias a su estructura macro-coloidal. Recientemente se ha confirmado que las SH tienen la capacidad de incrementar la viscosidad intestinal y reducir la traslocación bacteriana del intestino hacia el hígado [22]. Adicionalmente, se ha reportado que las SH regulan positivamente la expresión génica relativa para mucina-2 (MUC-2) [23]. Estos hallazgos sugieren que las SH podrían estar fortaleciendo la capa protectora de moco en el intestino delgado, favoreciendo el mantenimiento de la integridad de las vellosidades intestinales ante agentes infecciosos, toxinas, o ante cambios de alimento.  El objetivo del presente estudio fue evaluar un extracto de SH proveniente de una lombricomposta, como una alternativa para sustituir a los APC, sobre el comportamiento productivo, morfometría y número de células caliciformes en las vellosidades del yeyuno en pollos de engorda mantenidos en condiciones de bajo desafío o alto desafío por cambios de alimento previos al sacrificio.

Materiales y Métodos

Lugar de estudio

Extracción de Sustancias húmicas

Las SH se obtuvieron a partir de humus de lombriz roja californiana, alimentadas con estiércol de borrego previamente dándole un pre-compostaje. Se siguió parte de la metodología descrita por Domínguez et al., 2019 [14], y modificaciones para extracción a gran escala. La obtención de SH consistió en dos procesos de extracción alcalina con hidróxido de sodio a 0.5M y después a 0.1M, usando una proporción de 5:1 (L de NaOH / Kg de humus de lombriz) con una digestión y reposo de 24 h cada una, en donde los precipitados se separaron de la parte líquida. También se usó un lavado de los precipitados con agua destilada. Las fracciones líquidas obtenidas de las extracciones con NaOH y el lavado con agua destilada se mezclaron y se pasaron por cuatro filtros, dos de malla de algodón y dos de poliéster monofilamento con abertura de 92 µ para separar los residuos sólidos. Finalmente, la fracción líquida que contenía a las SH se secó en estufa de aire forzado a 55 °C durante 24 h, y se molieron usando un molino con un tamiz de 1 mm hasta obtener un polvo negro y fino.

Animales, tratamientos y diseño experimental

Se utilizaron 90 pollos machos Ross 308 de 14 a 38 días de vida, alojados en jaulas individuales, provistos de agua y alimento a libre acceso. El experimento consistió en dos etapas. En la primera etapa del día 14-28 considerada de bajo desafío, todos los animales fueron alimentados con una dieta basal (dieta 0) establecida con maíz blanco y pasta de soya (cuadro 1) y fueron asignados a tres tratamientos: 1 = dieta adicionada con promotores del crecimiento (0.05% de BMD y 0.05% de salinomicina), 2 = dieta sin APC (SAPC), 3= dieta con 0.3% de SH. Los pollos fueron pesados a los 14 y 28 días. Después del pesaje del día 28, se sacrificaron seis pollos de cada tratamiento para llevar a cabo estudios histológicos de las vellosidades. En la segunda fase del experimento del día 28-38, se tuvieron seis tratamientos, manteniendo los mismos tres tratamientos descritos previamente, pero usando dos dietas: A) alimento con base en maíz blanco, pasta de soya y granos secos de destilería con solubles (DDGS) y B) alimento con base en maíz blanco y maíz azul, pasta de soya y DDGS (cuadro 1). El día 29, esto es, 24 h después del cambio de dieta, se sacrificaron seis pollos de cada tratamiento. El día 37, se hizo un intercambio de dietas dentro de tratamientos, los pollos asignados a la dieta A recibieron la dieta B y viceversa. El día 38, 24 h después del intercambio de dietas, se pesaron y sacrificaron el resto de los pollos. 

Al inicio de la segunda fase, los pollos vivos fueron vacunados contra Newcastle, Salmonella y Bronquitis infecciosa por vía subcutánea en el cuello. Las dietas experimentales se formularon con base a lo recomendado en los manuales de la estirpe. Se calculó el consumo diario de alimento, ganancia diaria de peso y conversión alimenticia. Después de cada sacrificio se colectaron muestras intestinales de la región media del yeyuno en cada pollo, y los tejidos se fijaron en formol bufferado al 10%, y posteriormente fueron embebidos en parafina. Se realizaron cortes histológicos de 5µm de grosor y fueron procesados mediante diversas tinciones: hematoxilina y eosina para el análisis morfométrico de las vellosidades; PAS de Schiff para identificar mucinas neutras; azul alcián pH 1.0 para identificar mucinas ácidas sulfatadas; y a pH de 2.5 para identificar mucinas no sulfatadas. Usando un microscopio en campo claro con cámara digital a color y con el objetivo 5 X, se tomaron 10 fotografías completas e íntegras de cada pollo para estimar la altura, el diámetro y área aparente de las vellosidades mediante el software AnalySIS optibasic, SIS^®. Para estimar el área aparente se usó la siguiente fórmula: (2 π) x (ancho/2) x (largo) [17,18], y se expresó en mm2. Se cuantificó el número de células caliciformes reactivas a las diversas tinciones para mucinas, para esto, se tomaron 10 fotografías de la región media de las vellosidades usando un microscopio invertido con el objetivo 20 X. El conteo de las células caliciformes se realizó en un área cuya longitud fue de 250 µm por el ancho de la vellosidad mediante el software Leica LAS Interactive Mesurement. El número de células caliciformes se expresan por área de las vellosidades.

Análisis estadístico

Los resultados se sometieron a análisis de varianza usando un diseño completamente al azar. En la etapa de 14-28 días se tuvieron tres tratamientos y en la etapa de 29-38 días se tuvieron seis tratamientos producto de un arreglo factorial de tres tratamientos y dos dietas. 

Resultados

No se observó efecto de los tratamientos en los parámetros productivos en los períodos de 14-28 y 29-38 días. En el período de 14-38 días se observó menor (p <0.05) conversión alimenticia los tratamientos con APC y SH comparados con SAPC (Cuadro 2).

Morfometría de las vellosidades y número de células caliciformes a los 28 días

El grosor y el área de las vellosidades fueron menores con APC y SH con respecto a SAPC (p <0.01) (Cuadro 3). El número de células neutras, ácidas sulfatadas, ácidas no-sulfatadas y el total de células caliciformes por vellosidad fue menor (p < 0.01) con APC y SH comparados con SAPC (Cuadro 4).

Morfometría de las vellosidades y número de células caliciformes a los 29 días

La altura de las vellosidades fue mayor con la dieta A respecto a B (p < 0.05). El grosor y área de las vellosidades con dieta A y APC fue mayor (interacción Dieta y PAC, p <0.05) con respecto a SAPC y SH y con dieta B fueron iguales entre tratamientos (Cuadro 3). El número de células neutras fue mayor (p < 0.01) con dieta A comparada con B, y fue mayor con APC y SH comparados con SAPC. El número de células ácidas sulfatadas fue mayor con dieta A adicionada con APC comparada con SAPC y SH; con dieta B no hubo diferencias entre tratamientos (interacción dieta y tratamiento, p< 0.01). El número de células ácidas no-sulfatadas fue mayor con dieta A comparado con dieta B (p < 0.01), y fue mayor con APC y SH que con SAPC (p < 0.01). El número total de células caliciformes por vellosidad fue mayor en los pollos que recibieron dieta A comparados con dieta B (p< 0.01), y fue mayor (p< 0.01) con APC, intermedio con SH y menor con SAPC (Cuadro 4).

Morfometría de las vellosidades y número de células caliciformes a los 38 días

No hubo diferencias entre tratamientos en la altura de las vellosidades. El grosor y área de las vellosidades con dieta A fue mayor con APC y SAPC comparados con SH (interacción de Dieta y APC, p <0.01) y con la dieta B fue menor con APC comparado con SAPC y SH (Cuadro 3).  El número de células neutras fue menor con dieta A comparado dieta B (p < 0.01).  El número de células ácidas sulfatadas con dieta A fue menor con APC y SH comparado con SAPC, y con la dieta B fue mayor con APC, intermedio con SAPC y menor con SH (interacción Dieta y APC, (p < 0.01). El número de células ácidas no sulfatadas y el total de células con dieta A fue menor con APC comparado con SAPC y SH (interacción Dieta y APC, p < 0.01) y con dieta B fue mayor con APC y SAPC comparado con SH (Cuadro 4).
 

Discusión

Se ha observado que las SH de origen comercial y las obtenidas a partir de humus de lombricomposta, han tenido resultados favorables en la modulación del crecimiento y conversión alimenticia en aves cuando se administran en el alimento o en agua de bebida [14,15,24]. En el presente estudio con la suplementación de SH extraídas de lombricomposta se observó mejora en la conversión alimenticia en pollos de 14 a 38 días de edad. En otros reportes también se ha encontrado disminución de la conversión alimenticia en pollos suplementados con las SH [15,16, 24,25, 26].

En cuanto a la morfología de las vellosidades se ha visto que bajo condiciones de crianza en piso las SH o sus derivados como los AH e incluso como humatos de potasio o integrados en una mezcla con otros componentes comerciales, administrados ya sea en el alimento o en agua, mejoran la digestibilidad y la utilización de nutrientes al aumentar la altura, el diámetro o el área de superficie de las vellosidades intestinales teniendo un efecto favorable sobre el crecimiento [6,16,17,27]. En el presente estudio, a los 28 días los pollos suplementados con SH mostraron reducción del diámetro y área aparente de las vellosidades del yeyuno, induciendo un comportamiento similar al de los pollos con APC, comparados con los pollos SAPC. De acuerdo con lo reportado por Miles et al. (2006) [28], una de las peculiaridades de los antibióticos es la reducción de las características macroscópicas y microscópicas del intestino en pollos de engorda. Los APC en las dietas promueven el equilibrio de la microbiota intestinal y a su vez reducen la capacidad de los microorganismos de provocar una respuesta inflamatoria, permitiendo una mayor eficiencia y recolección de nutrientes para el huésped; de esta forma los antibióticos mejoran el crecimiento animal [4, 29].

En el periodo de 14-28 días se mantuvo un bajo desafío de los pollos ya que, el alojamiento en jaulas individuales reduce los factores causantes de estrés encontrados en pollos alojados en grupos, permitiendo a los animales mantener un buen estado de bienestar, a diferencia de cuando son criados en piso, en donde los pollos están expuestos a diferente tipo e intensidad de estrés. Se sabe que factores desencadenantes de estrés pueden causar cambios en la microbiota intestinal normal y su estructura epitelial, lo que puede conducir a una mayor adherencia de bacterias como Salmonella Enteritidis [30]. 

Dentro del mecanismo natural de protección intestinal, el moco es de los elementos extracelulares que actúan contra el daño químico de agentes patógenos y de toxinas, y ayuda a evitar el daño mecánico ya que mantiene la hidratación y la lubricación, reduciendo la fricción entre las superficies de la mucosa [31]. Las mucinas son uno de los componentes estructurales del moco [32]. En el presente estudio a los 28 días el número total de células caliciformes de los tres tipos de mucina secretora evaluados en el yeyuno se redujo con APC y SH respecto a SAPC. Lo que sugiere que en condiciones de no desafío la proliferación de patógenos y de toxinas en el epitelio podría ser menor, y, en consecuencia, menor descamación y reciclaje celular, manteniéndose una producción de mucinas a un nivel inferior a la de los pollos como se ha observado con el uso de APC.

Mientras que, a los 29 días con el desafío del cambio de dietas, se observó un ajuste del intestino sobre la morfología del yeyuno, y se encontró que al recibir APC el diámetro y área aparente de las vellosidades fueron mayores usando la dieta A, respecto a los animales con SH y SAPC, incluso comparados con todos los tratamientos de la dieta B. Las SH no lograron aminorar los efectos del cambio drástico de alimento, probablemente porque la dieta causó deterioro y desprendimiento celular en el corto plazo. La atrofia de las vellosidades observada con la dieta B podría ser debido al mayor contenido de fenoles disponibles en el maíz azul, lo que implica mayor desafío adicional al originado por la inclusión de DDGS en las dietas. Mientras que el uso de APC ayudo a mantener la integridad de las vellosidades cuando se desafía a los animales a un cambio inmediato de alimento, y posiblemente redujo el efecto negativo que originan las bacterias patógenas durante el cambio de dieta. En cuanto al número de células caliciformes al día 29, se observó que la respuesta varió en cada tratamiento, y que fue independiente de lo que pasa con la histología de las vellosidades. En este estudio se observó mayor número de células caliciformes con APC, intermedio con SH y bajo con SAPC en la dieta A. Estos resultados pueden ser el reflejo de la potencial función protectora que ejercen las SH obtenidas a partir de una lombricomposta, sobre la mucosa intestinal ante cambios repentinos de alimento. Posiblemente el aumento de las células caliciformes conlleva a una mayor producción de mucinas y de moco. Después de lo reportado por Maguey-González et al. (2018) [22], al confirmar que los AH reducen la translocación bacteriana y aumentan la viscosidad intestinal, aunado al aumento en la expresión relativa de MUC-2 en el intestino con el uso de SH, reportado por Mudroñová et al. (2020) [23]; la conversión alimenticia podría estar siendo mejorada por esta vía, gracias a la formación de un epitelio protector de moco en el tracto gastrointestinal como fue sugerido previamente [21]. A los 37 días la finalidad de intercambiar las dietas fue volver a inducir cambios en la morfología de las vellosidades, sin embargo, los animales habían recibido un consumo de APC o SH por 23 días continuos; y dentro del intercambio de dietas, el cambio de alimento está implícito, aunque solo se redujo o incremento el desafío al adicionar o retirar el maíz azul. Al intercambiar las dietas, cuando recibieron la dieta A el diámetro y área con APC son más chicas que con SH. Controversialmente el efecto fue opuesto al recibir la dieta B y morfológicamente las vellosidades fueron más pequeñas con SH y con APC más grandes. En cuanto a las células caliciformes en el yeyuno se observó que la respuesta fue similar a lo encontrado en el área aparente, esto es, a menor área de superficie, menor número de células caliciformes.

Conclusiones

Es viable uso de SH obtenidas a partir de una lombricomposta como alternativa a la sustitución de APC al mejorar la conversión alimenticia. En condiciones de no desafío, los APC y las SH tienen efecto similar en la morfología de las vellosidades y el número de células caliciformes. Después de un desafío, las SH no evitan la atrofia de la mucosa intestinal, pero aumentan el número de células caliciformes, y probablemente, la producción de mucinas y, por ende, la capa de moco, en comparación con SAPC.

Agradecimientos 

A CONACYT por los recursos económicos concedidos para la realización de esta investigación a través del proyecto “Eficacia de un extracto de sustancias húmicas como promotor del crecimiento, reducir las enfermedades infecciosas y aumentar la producción rentable de carne y cerdo”, número 4777.
 

Bibliografía