Jaramillo Meza Laura¹, Díaz otero Fernando¹, Manzo Sandoval Anabelle¹, 
Hernández Andrade Laura
¹CENID-Salud Animal e Inocuidad del INIFAP
 

RESUMEN
 

La evaluación de los biomarcadores IL-17 e IP-10 se realizó mediante un ELISA tipo sándwich, empleando los anticuerpos monoclonales respectivos. Para lo cual, se muestrearon 20 becerras reactoras y 20 no reactoras a la prueba de la tuberculina, de las que se tomaron muestras de sangre heparinizada con el propósito de determinar los niveles IFN-%gamma%, de IL-17 y de IP-10 en cultivos de sangre completa y en cultivos de CMNSP estimulados con el CFPE de Mycobacterium bovis, de éstos últimos se realizó una cinética de producción a los 3, 5, 7 y 9 días. Los datos se analizaron con la prueba "t" de Student para determinar diferencias entre grupos. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo. Los resultados de evaluación de los biomarcadores analizados fueron significativos en los sobrenadantes de cultivos de las CMNSP derivadas de becerras reactoras desde el tercer día de cultivo. Observándose valores más altos de las citocinas y quimiocina evaluadas en los SNC obtenidos a los 9 días de cultivo en el grupo reactor en relación al grupo no reactor (P<0.01). En los cultivos de sangre completa también se alcanzaron índices de estimulación relevantes, por lo que para fines prácticos el empleo de cultivos de sangre completa estimulados con los antígenos micobacterianos específicos en la evaluación de IL-17 e IP-10 puede considerarse viable. Actualmente, en las estrategias de control, así como en el desarrollo de métodos inmunodiagnósticos se busca alcanzar una mayor definición sobre los espectros inmunológicos que se observan desde la eliminación del bacilo de forma inespecífica a la infección latente y en la enfermedad activa, por lo que estos biomarcadores muestran su utilidad para tal fin.
 

INTRODUCCIÓN
 

La tuberculosis bovina (TBb) es una enfermedad infecto-contagiosa producida por Mycobacterium bovis (M. bovis), especie perteneciente al Complejo Mycobacterium tuberculosis, que afecta al ganado bovino, principal hospedero natural de la bacteria, que guarda importancia por el riesgo que representa para la salud humana y por los efectos negativos que ocasiona a la industria pecuaria, debido a su carácter enzoótico ^{2, 3, 5}.  El enfoque “Una salud” se considera una  necesidad crítica para abordar las enfermedades zoonóticas, y es una estrategia mundial para expandir las colaboraciones y comunicaciones interdisciplinarias en todos los aspectos de la atención médica para humanos, animales y el medio ambiente. En lo que respecta a la tuberculosis, esta estrategia puede acelerar el desarrollo de nuevas pruebas de diagnóstico para humanos y ganado, pero también mejorar los programas de vigilancia, control y erradicación de la tuberculosis ⁶. 
 

En relación a ello, y considerando que la inmunidad hacia la tuberculosis bovina es básicamente de tipo celular, implicando una serie compleja de interacciones entre varias poblaciones celulares, que tienen como finalidad controlar la infección, así como prevenir al hospedero de posibles reactivaciones ^10,11. Primeramente, y luego de la activación de los linfocitos T por la interacción con los antígenos micobacterianos, las células Th0 se diferenciarán en distintos linajes, como: Th1, Th2, Th17 o T reguladoras (Treg), dependiendo de las interacciones que se establecen entre la célula presentadora de antígeno y el linfocitoTh0, así como su afinidad por el MHC y el tipo de citocinas en el entorno de la interacción. Las células Th1 producen principalmente IFN-%gamma%, IL-2, TNF-α, linfotoxina alfa (LT-α) y el factor de transcripción T-bet. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-13 y expresan el factor de transcripción GATA-3. Las células Th17 secretan IL-17A, IL-17F, IL-22, así como GM-CSF y otras citocinas (TNF, IFN-%gamma% IL-21 e IL-26) ^1,7,8,9.  El interferón gamma (IFN-%gamma%) es una de las moléculas efectoras más crítica, para el control de la infección por micobacterias, debido a ello, su evaluación como uno de los principales mediadores de la respuesta inmune celular es considerada para realizar el diagnóstico de la enfermedad, bajo condiciones in vitro ^{14, 16}. Más recientemente, se ha considerado desarrollar otros métodos más efectivos para el diagnóstico de la enfermedad en humanos y en bovinos, considerando la evaluación de otros biomarcadores inmunes ^12,13. 
 

Estos biomarcadores potenciales incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-2, IL-1β, IL-17A y la proteína-10 inducida por el IFN-%gamma% (IP-10) ^{10, 12}. La IP-10 e IL-17A, en particular, tienen el potencial de usarse para diferenciar entre TB activa y latente en humanos ^{9, 12}. Sin embargo, hay unos pocos estudios sobre la detección de citocinas relacionadas con la TBb.

MATERIAL Y MÉTODOS 
 

La evaluación de los biomarcadores IL-17 e IP-10 se realizó mediante pruebas inmunoenzimáticas (ELISA) tipo sándwich previamente estandarizadas, empleando los anticuerpos monoclonales respectivos. Para lo cual, se muestrearon 20 becerras reactoras y 20 no reactoras a la prueba de la tuberculina, de las que se tomaron muestras de sangre heparinizada (dos tubos por animal) con el propósito de determinar los niveles IFN-%gamma% por IGRA (interferon gamma assay release), de IL-17 e IP-10 en cultivos de sangre completa y en cultivos de CMNSP estimulados con el CFPE de M. bovis, de éstos últimos se realizó una cinética de producción a los 3, 5, 7 y 9 días. Además, se tomaron muestras de exudado nasal y de sangre para realizar pruebas de PCR y ELISA, respectivamente para confirmar la enfermedad en los animales. La PCR que se realizó amplifica un segmento de 372 pb del gen MPB70 de las micobacterias del complejo M. tuberculosis, empleando los iniciadores TB1-F, 5’GAACAATCCGGAGTTGACAA3’ y TB1-R, 5’AGCACGCTGTCAATCATGTA3’, reportados por Cousins., et al. (1992)⁴.
 

Uno de los tubos de sangre heparinizada de cada animal se distribuyó en placas de 48 pozos a razón de cuatro pozos por animal, para estimulación antigénica in vitro con el PPD bovino, PPD aviar y dejo un pozo sin estimular como control, esto con la finalidad de evaluar la producción de IFN-α liberado por los linfocitos T específicos a los antígenos micobacterianos. Luego de 18 a 24 h de incubación se colectaron los plasmas de los diferentes cultivos. 
 

Mientras que, del otro tubo de sangre heparinizada de los animales se separaron las células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) en gradiente de Ficoll-hypaque. Las células se suspendieron y ajustaron a una concentración de 1x10⁶ células/ml. Éstas se distribuyeron en placas de 48 pozos, considerando dos pozos por animal, uno de los cuales se estimuló con un extracto proteico de filtrado de cultivo (CFPE) de M. bovis y el otro quedo como control, sin estimular. De algunos animales se efectuaron cultivos cuadruplicados, para realizar una cinética de producción de las citocinas y quimiocina a evaluar. De los diferentes cultivos se colectaron los sobrenadantes de cultivo (SNC) que fueron almacenados a -70°C hasta el momento del desarrollo de las pruebas. El IFN-α se cuantificó por un ELISA tipo sándwich comercial. En los plasmas colectados de estos cultivos también se cuantificó la IL-17 e IP-10 empleando los ELISAS sándwich caseros estandarizados. Los datos se analizaron con la prueba "t" de Student utilizando el programa informático Statistical Analysis System (SigmaStat Ver. 3.5) para determinar diferencias entre grupos. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo ¹⁵.
 

RESULTADOS 
 

Los resultados de cinética de producción de IL-17 e IP-10 en los cultivos de CMNSP se muestra en las Figuras 1a y 1b para la citocina IL-17A, donde se puede observar niveles de producción significativos en los sobrenadantes de cultivos derivados de becerras reactoras desde el tercer día de cultivo, los cuales fueron más altos en los SNC colectados a los 7 y 9 días de incubación; mientras que, en becerras no reactoras los niveles se mantuvieron prácticamente nulos, sin variación en el tiempo.
 

En la Figura 2 se muestran los resultados de evaluación del IFN-%gamma%, IL-17 e IP-10 en los plasmas y SNC obtenidos para los bovinos positivos a las diferentes pruebas diagnósticas realizadas para confirmar su estatus de animal tuberculoso (tuberculina doble comparativa, IGRA, ELISA y PCR). Observándose valores más altos de las citocinas y quimiocina evaluadas en los SNC obtenidos a los 9 días de cultivo de las CMNSP estimuladas con el CFPE en el grupo reactor en relación al grupo no reactor (P<0.01); no obstante, los resultados obtenidos en plasma para la cuantificación de estos biomarcadores, aunque son más bajos no dejan de ser significativos. Así los resultados del estudio muestran claras diferencias en la producción de las citocinas proinflamatorias evaluadas, por lo que representan excelentes biomarcadores para determinar el progreso de la enfermedad.
 

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 
 

Actualmente, en las estrategias de control, así como en el desarrollo de métodos inmunodiagnósticos se busca alcanzar una mayor definición sobre los espectros inmunológicos que se observan desde la eliminación del bacilo de forma inespecífica a la infección latente y en la enfermedad activa, por lo que los biomarcadores evaluados en el estudio muestran su utilidad para posibles fines diagnósticos. Mayormente en el análisis de evaluación del potencial uso de la IL-17 e IP-10 se realizó tanto en cultivos de sangre completa como en sobrenadantes de cultivo de CMNSP de animales tuberculosos y sanos, y si bien los resultados de evaluación fueron altamente significativos en los SNC, en los cultivos de sangre completa alcanzaron índices de estimulación también relevantes, por lo que para fines prácticos el uso empleo de cultivos de sangre completa estimulados con los antígenos micobacterianos específicos en la evaluación de IL-17 e IP-10 puede considerarse viable. Además, las respuestas de IL-17A e IFN-%gamma% mostraron estar están altamente correlacionadas, es así que, la capacidad diagnóstica de la IL-17 puede ser similar a la del interferón gamma, recordemos que ya existe una prueba comercial que emplea esta última citocina con este fin. La evaluación de IL-17 más que la IP-10 en cultivos de CMNSP y en cultivos de sangre completa estimulados con el extracto proteico de filtrado de cultivo de M. bovis mostró ser significativa en bovinos tuberculosos, por lo que su cuantificación con fines inmunodiagnósticos de la enfermedad resulta potencialmente factible. La quimiocina IP-10 inducida por IFN-, expresada por linfocitos y monocitos, se produce en niveles elevados en humanos, ganado y búfalos africanos, hasta 100 veces más que IFN-%gamma%, después de la infección con micobacterias tuberculosas.
 

La quimiocina IP-10 inducida por IFN-%gamma%, expresada por linfocitos y monocitos, se produce en niveles elevados en humanos, ganado y búfalos africanos, hasta 100 veces más que IFN-%gamma%, después de la infección con micobacterias tuberculosas. La IP-10 ha mostrado poseer un papel importante en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado, y de acuerdo a estudios realizados los niveles de IP-10 inducidos por antígeno se han mostrado prometedores para la detección temprana de la infección por M. bovis en animales que pueden dar negativo en otras pruebas, como los IGRA¹³. Estudios realizados en bovinos inmunizados con la vacuna BCG y en bovinos tuberculosos naturalmente infectados mostraron una alta correlación entre las respuestas de IL-17A e interferón gamma asociadas a protección, mayormente exhibieron capacidades de diagnóstico similares. Actualmente, en las estrategias de control, así como en el desarrollo de métodos inmunodiagnósticos.

 

“se busca alcanzar una mayor definición sobre los espectros inmunológicos que se observan desde la eliminación del bacilo de forma inespecífica a la infección latente y en la enfermedad activa, por lo que estos biomarcadores muestran su utilidad para tal fin.”

 

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AGRADECIMIENTOS Y FUENTE FINANCIERA
 

Los resultados son parte del proyecto fiscal del INIFAP “Evaluación de biomarcadores inmunes asociados a la eficacia vacunal contra la tuberculosis bovina y su efecto comparativo con la mejora del estado sanitario de los hatos”. No. SIGI 142 945 340 13
 

LITERATURA CITADA